频域调制受激辐射损耗显微术,精准去背景噪声

远场荧光光学显微镜因其对生物组织的低损伤性和在生物医学研究中的成像特异性,而成为了解微观世界的重要工具.然而,传统远场光学显微镜的分辨率主要决定于照明光源的波长,由于衍射极限的存在,照明光源的半波长是分辨率的理论极限.在过去三十年中,超分辨显微技术的发展突破了这一瓶颈.作为超分辨显微技术的主流技术之一,受激辐射损耗（STED）显微技术,近年来取得了长足的进步,并已广泛应用于实际研究中.

实际上,在STED成像过程中,除了探测器的背景噪声外,还存在一些其他的不良的背景信号,这些背景信号大大影响了空间分辨率和图像质量.一般来说,这些背景信号主要来自两个方面：（i）由于损耗光的超高光剂量而二次激发产生的荧光；（ii）由于损耗光功率不足而产生的残余荧光信号.过去十年中STED去背景技术发展迅速,目前背景去除方法可分为三类：时域法、空域法和相量域法.

近期,浙江大学刘旭和匡翠方教授研究组提出了一种基于频域调制的STED技术(Dual-modulation difference stimulated emission depletion microscopy, dmdSTED）,称为"双调制差",可以有选择地抑制背景信号(图1),相关结果以"Dual-modulation difference stimulated emission depletion microscopy to suppress the background signal"为题,发表在Advanced Photonics 2022年第4卷第4期.该方法在传统STED成像装置中引入强度调制器和锁相放大器,对激发光和损耗光分别进行时间调制,得到时间调制的荧光信号；通过在频域进行处理,将有效信号、二次激发信号、未损耗完全信号在频域上以特定频率值分开；最后用锁相放大器解调有效荧光,选择性地去除背景信号,从而得到超分辨成像.

该成像方法已经成功应用于生物细胞和钙钛矿成像中,分辨率可达λ/8,具有无需特殊荧光标记、低照明光强、高信噪比等优点.研究人员通过细胞实验验证了dmdSTED的有效性(图2).激发光和损耗光的调制频率分别为50 kHz和80 kHz.共焦、STED和dmdSTED的信噪比分别为8.79(a)、8.86(b)和11.55(c).因此,与传统的STED相比,dmdSTED信噪比提高了30.4%.图2(d-f) 是图2(a-c)中部分区域的放大结果图,明显看出,dmdSTED可以有效地去除STED中的背景信号.通过傅里叶环相关（FRC）分析,结果表明共焦、STED和dmdSTED的空间分辨率分别为225 nm、91 nm和74 nm.也就是说,与传统的STED相比,dmdSTED空间分辨率提高了22.9%.

图2 dmdSTED在细胞成像中的应用

有机金属卤化物钙钛矿作为下一代太阳能电池的候选材料,正引起人们极大的研究兴趣.钙钛矿的一个显著特点是其高量子效率,包括反斯托克斯荧光,因此将钙钛矿样品引入到dmdSTED实验中,可以更好的验证dmdSTED消除反斯托克斯荧光噪声的能力.共焦、STED和dmdSTED在钙钛矿中的成像结果显示：dmdSTED可以有效过滤反斯托克斯荧光.（图3）通过傅里叶环相关（FRC）分析表明,共焦、STED和dmdSTED的空间分辨率分别为320 nm、241 nm和205 nm.进一步证明,dmdSTED可以有效地分离不同类型的信号并提高成像分辨率.

图3 dmdSTED在钙钛矿成像中的应用

STED的创新之处在于通过荧光开关从能级的角度区分荧光分子,绕过了空间衍射极限.dmdSTED在频谱中鉴别检测到的信号,有利于区分很难在空间域或时间域中区分的信号.同时,dmdSTED方法具有λ/8的空间分辨率,也高于容易受散粒噪声影响的相量域方法.

此外,dmdSTED不受限于脉冲或连续光光源,且不需要时间相关单光子计数（TCSPC）等硬件.与空间域方法相比,dmdSTED的时间分辨率不受限制.这些都有利于发挥dmdSTED在应用中的潜力,可以集成到其他双光束点扫描技术中,如激发态饱和显微（ESSat）、电荷态耗尽显微（CSD）、基态耗尽显微（GSD）等.研究人员认为,在未来的研究中,还可以采用高频调制设备（1MHz以上）,以实现活细胞的实时成像.