基于光学相干层析成像散射量化表征细胞分布的研究 
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1 引言
非侵入性、无标记的可视化和量化三维组织模型中的细胞分布对组织工程领域的研究具有重要意义。使用先进的成像技术监测细胞变得越来越重要,如细胞的分布、运动及生长情况。目前,细胞分布定量方法包括使用荧光共聚焦显微镜(CM)对经过冷冻切片的支架成像,然后进行数字图像重建[1]。这种方法虽然精确,但具有破坏性,且耗时长,成像深度低于300 μm,因此,对大量样品进行深度分辨检测时无法实现实时在线检测。多光子显微镜扩展了CM的成像深度,但穿透深度仅为几百微米以下,并且使用的高功率激光可能损伤细胞[2-4]。光声显微成像最大可以实现10 mm以上的成像深度,但其成像分辨率只有30~100 μm,无法分辨生物组织内部的精细结构[5];此外,磁共振成像和微计算机断层扫描已被用于评估组织工程支架中的细胞分布,但成像分辨率有限,且这类技术具有高能辐射等危险,成本较高,不适合用于实时和连续成像[6]。
光学相干层析成像(OCT)技术基于低相干干涉原理,依据后向散射特性和折射率差异来识别样品内的微观结构,无需荧光标记或其他外源对比剂,就能对活体样品进行非接触、非侵入的横断面实时成像[7-8]。因此,OCT技术非常适用于工程组织的无创监测,且已被用于表征组织工程支架中的细胞分布、生长和迁移。Bagnaninchi等[9]利用细胞在组织内的运动作为内源性对比,通过光学相干相位显微术(OCPM)探测细胞运动产生的相位浮动,根据相位区分组织材料和活细胞,从而得到细胞在三维组织模型中的分布情况。同样,Holmes等[10]利用OCPM实现了定量相位成像,将与活细胞运动相关的相位波动映射到图像中,实现了组织材料和细胞的区分。因此,利用OCPM探测由活细胞的运动性引起的光学波动的方法使得在三维组织模型实现细胞分布的可视化具有一定的可行性,但该类方法对于光学系统较为敏感,易受环境噪声影响,因此对系统灵敏度要求较高,从而使得系统成本较高。Tan等[11]使用OCT技术实现了三维组织模型微观结构的非侵入式成像,并探索了工程组织的生长过程。利用OCT技术能清楚地识别出组织微结构和细胞分布,且因为OCT技术依赖的是介质的折射率和光学散射特性的变化,所以不需要外源荧光团即可分辨组织材料和细胞之间的差异。同时,有研究表明,细胞和支架材料的散射特性不同,细胞在OCT图像中表现为明亮的区域,这初步证明了将基于散射差异的OCT技术用于检测工程化组织中细胞分布的可行性[12]。此外,还有相关研究利用OCT技术测量细胞的散射系数,用于区分鼻咽癌细胞系光学特性的内在差异[13],检测细胞的凋亡过程[14],以及鉴别活细胞、坏死细胞、凋亡细胞[15-16]。同时,对散射信号进行测量和分析能够得到与粒子浓度和粒径等有关信息[17]。这些应用表明了基于散射系数进行细胞检测的可行性。这类研究主要关注的是相对均匀的同种类型介质的散射系数或计算组织的整体散射系数,较少注意深度分辨散射系数的分布特性。
本文提出一种基于OCT干涉光谱信号确定深度分辨散射系数的方法,该方法利用OCT大部分光在成像深度范围内衰减成像的特性,基于单散射模型计算局部的衰减系数,将OCT干涉光谱信号数据集中的每个像素转换为衰减系数数据集中的相应像素,无需分割区域以及进行大量的平均,即可确定整个成像范围内每个像素的散射系数。本文首先构建多层散射模型,验证该方法深度分辨多层散射体模型的有效性。接着,计算不同浓度细胞悬浮液的散射系数分布,以及生物三维(3D)打印细胞负载水凝胶支架的散射系数分布,以此展示基于深度分辨散射系数表征细胞分布的可行性,并通过H&E染色对照验证散射分布检测的准确性。
2 系统和方法
2.1 OCT成像
采用自制的高分辨谱域OCT系统[18]进行组织模型无损成像和介质散射系数分布测量。系统采用中心波长为1310 nm、半峰全宽为245 nm的宽带光源,系统的轴向分辨率为5.5 μm,横向分辨率为13 μm,每个纵向扫描(A-Scan)的采样率为48 kHz。空气中,系统成像深度达到3.5 mm,物镜焦距为25.1 mm,所有扫描过程中焦点聚焦至样品表面。对于多层介质散射模型,采集的图像大小为3 mm×3.5 mm。对于细胞悬浮液,在扫描过程中为避免液面的强烈反射,采集的图像尺寸为3 mm×3.5 mm,对应的像素为600 pixel(x)×1024 pixel(z),每个A-scan重复采集10次取平均值。对于水凝胶支架,采集的图像尺寸为10 mm×3.5 mm,为降低系统噪声,每个A-Scan采集20次取平均值。
2.2 散射系数分布计算方法
根据单次散射模型[19-20],检测到的OCT信号功率I(z)与来自样本的反射光强度成正比,并且与均匀介质中某一深度z处的散射与吸收有关,可以描述为
式中:μ=μa+μs表示介质的衰减系数,μa为吸收系数,μs为散射系数,由于组织对波长在800~1400 nm的近红外光的散射远大于吸收,因此衰减系数可近似为散射系数。(1)式中的2倍关系是因为光束两次通过组织。散射系数可以通过对OCT信号的对数进行求导得出[21]:
对(2)式加以推导,并将连续的A-Scan信号离散化至CCD相机1024个纵向采样点上,得出散射系数μs与深度方向上各采样点功率的关系式,即
式中:Δ表示纵向像素大小;I[i]表示纵向深度方向第i个采样点的功率。每个点的散射系数依赖于该点以下所有采样点的功率之和,因此在纵向扫描的末端,可用于散射系数计算的像素数较少,散射系数的计算误差偏大。考虑到待测对象对应的有效穿透深度,计算纵向扫描方向的散射系数时有效像素数仅取了800 pixel。大小为n×m的OCT强度图像的散射系数分布图像的重建过程如
图 1. 散射系数分布图像重建过程
Fig. 1. Reconstruction process of scattering coefficient distribution image
2.3 信号直方图统计分析
在每个样本的随机位置采集10组OCT强度数据集,使用(3)式计算每组强度数据集对应的散射系数数据集,绘制频率分布直方图,强度和散射系数的频率分布直方图的组距分别设置为0.5 dB和0.1 mm-1。记录每组强度和散射系数频率分布直方图峰值处的强度值以及散射系数值,统计分析方法采用配对t检验,数据以平均值±标准差表示,以p<0.05来表征细胞浓度以及水凝胶加入细胞前后的散射特性差异具有统计学意义。
3 实验结果
3.1 散射系数计算方法验证
为验证深度分辨散射系数计算方法的准确性,本文制作了多层介质散射模型,具体结构如下:盖玻片-聚苯乙烯(PS)微球溶液-盖玻片-1% IntralipidTM-盖玻片。PS(麦克林试剂,中国)和Intralipid(华瑞制药有限公司,中国)是两种标准的散射样品,对可见光和近红外光有高散射,且对光的吸收非常弱,通常用于模拟组织样品。PS微球的直径为5 μm,单位容积(mL)微球数为6.05×106,在1310 nm中心波长条件下,PS微球的折射率为1.5692+0.003i,水的折射率为1.3236[22]。根据这些参数,由Mie散射理论[23]可以得到PS微球溶液的散射系数为0.289 mm-1。Intralipid主要成分为大豆油、卵磷脂和甘油,其中大豆油和卵磷脂为主要的散射介质,而甘油溶于水变为单个分子,与光作用不发生散射效应。
图 2. 多层介质散射模型的OCT图像及散射系数分布。(a) OCT强度图像;(b)本文方法计算的散射系数分布图像;(c)图2 (b)中白色虚线框处模型对应的散射曲线
Fig. 2. OCT image and scattering coefficient distribution of the multilayer dielectric scattering model. (a) OCT intensity image; (b) scattering coefficient distribution calculated by the proposed method; (c) scattering curve corresponding to the model at the white dotted frame in Fig.2 (b)
3.2 细胞悬浮液散射系数分布
本文通过细胞悬浮液实验验证通过OCT深度分辨散射系数分布图识别不同浓度细胞分布的可行性。将人肝癌细胞C3A复苏后接种到75 mL的培养瓶中,加入含体积分数为95%的DMEM、5%的血清以及0.5 mL青霉素-链霉素混合液的完全培养基,并置于细胞培养箱中(37 ℃、5%CO2、饱和湿度)进行常规培养。细胞生长至培养瓶底面积的90%时,经胰酶消化再进行离心处理,然后去除上层清液,最后使用移液枪加入4 mL培养基吹散细胞使其均匀分布在培养基中,取10 μL培养基至细胞计数板计量细胞的个数,制备三种不同浓度的细胞悬浮液。
图 3. 不同浓度的C3A细胞悬浮液OCT强度图像与散射图像。(a1)~(a4) OCT强度图像;(b1)~(b4) OCT散射图像
Fig. 3. OCT intensity images and scattering images of C3A cell suspension with different concentrations. (a1)-(a4) OCT intensity images; (b1)-(b4) OCT scattering images
为量化细胞的浓度,分别对
图 4. 不同浓度细胞悬液的OCT强度及散射系数的频数分布直方图。(a1)~(a4)信号强度;(b1)~(b4)散射系数
Fig. 4. Frequency distribution histograms of OCT intensity and scattering coefficient for cell suspension with different concentrations. (a1)-(a4) Signal intensity; (b1)-(b4) scattering coefficient
图 5. 分布直方图最大频数对应的参数值与细胞浓度的关系曲线。(a)强度值与细胞浓度的关系曲线;(b)散射系数值及背景峰和细胞特征峰的间距与细胞浓度的关系曲线
Fig. 5. Relationship between the parameters of the maximum frequency of the distribution histograms and the cell concentration. (a) Relationship between intensity and cell concentration; (b) relationship among scattering coefficient, distance between background peak and cell characteristic peak, and cell concentration
3.3 生物三维打印水凝胶支架的散射系数分布检测
为进一步验证本文采用的深度分辨散射系数分布图在三维组织模型中识别细胞分布的可行性,进行了生物三维打印水凝胶支架和细胞负载水凝胶支架的成像对比实验。利用10%的明胶和2%的海藻酸钠等比例混合支撑水凝胶,取3 mL水凝胶混入3×106个细胞得到浓度为1×106 mL-1的混合液。将不含细胞和含细胞的水凝胶放置于生物3D打印机(Bio-Architect Sparrow,杭州捷诺飞,中国)打印水凝胶支架,组织模型厚度达到3 mm。为形成良好的稳定结构,在打印好的支架中加入CaCl2交联剂交联1 min,再用PBS缓冲液清洗2~3次,之后将组织模型浸泡在PBS缓冲液中以防模型水化。在正常培养条件下,将处理好的打印组织模型用于OCT成像。OCT成像后使用4%的甲醛溶液固定支架,以备H&E染色切片检测。
图 6. 无细胞和含细胞水凝胶支架的OCT强度图像以及散射图像。(a1)无细胞的支架的OCT强度图像;(a2)含细胞的支架的OCT强度图像;(b1)无细胞的支架的散射图像;(b2)含细胞的支架的散射图像
Fig. 6. OCT intensity images and scattering images of cell-free and cell-containing hydrogel scaffolds. (a1) OCT intensity image of cell-free scaffold; (a2) OCT intensity image of cell-containing scaffold; (b1) scattering image of cell-free scaffold; (b2) scattering image of cell-containing scaffold
为进一步验证OCT散射系数分布识别细胞的有效性,本文对PBS缓冲液、无细胞支架、细胞负载水凝胶支架的OCT信号强度和散射系数分布进行了直方图统计,如
图 7. 水凝胶支架的信号强度与散射系数分布直方图。(a) PBS缓冲溶液的强度分布;(b)无细胞的支架的强度分布;(c)含细胞的支架的强度分布;(d) PBS缓冲溶液的散射系数分布;(e)无细胞的支架的散射系数分布;(f)含细胞的支架的散射系数分布
Fig. 7. Histogram of signal intensity and scattering coefficient of hydrogel scaffold. (a) Intensity distribution of the PBS buffer solution; (b) intensity distribution of cell-free scaffold; (c) intensity distribution of cell-containing scaffold; (d) scattering corefficient distribution of PBS buffer solution; (e) scattering corefficient distribution of cell-free scaffold; (f) Scattering corefficient distribution cell-containing scaffold
3.4 OCT检测细胞分布准确性验证
为验证利用OCT深度分辨散射系数检测水凝胶支架内细胞分布的准确性,需证明
图 8. 水凝胶支架的OCT强度图像、散射图像与H&E染色切片结果对比。(a1)无细胞水凝胶支架的OCT强度图像;(a2)细胞负载水凝胶支架的OCT强度图像;(b1)无细胞水凝胶支架的散射图像;(b2)细胞负载水凝胶支架的散射图像;(c1)无细胞水凝胶支架染色切片图;(c2)细胞负载水凝胶支架染色切片图
Fig. 8. Comparison of OCT intensity images, scattering images and H&E stained sections for hydrogel scaffolds. (a1) OCT intensity image of cell-free hydrogel scaffold; (a2) OCT intensity image of cell-containing hydrogel scaffold; (b1) scattering image of cell-free hydrogel scaffold; (b2) scattering image of cell-containing hydrogel scaffold; (c1) stained sections image of cell-free hydrogel scaffold; (c2) stained sections image of cell-containing hydrogel scaffold
4 讨 论
光学散射系数μs是通过OCT信号的纵向衰减曲线拟合散射模型得到的,散射模型主要包括单次散射模型以及多次散射模型。多次散射模型[25-26]包含浅层散射与深层散射以及两者的相干项,且含有散射系数以及散射角的均方根这两个未知参数,对于该模型,难以解得散射系数关于深度的解析解。本文采用的深度分辨散射系数计算方法是在入射到样品光的功率和样品穿透深度已知的前提下进行的,通过对单散射模型求解散射系数与深度的解析解,得到深度分辨散射系数的计算方程,将每个采样点对应一个散射系数,可获得散射系数分布图像。多层散射介质模型的实验结果表明(
必须指出,本文设计的多层散射样品存在一些不合理的地方,例如glass属于强透光介质而非散射介质。由于PS微球和Intralipid的液体特性,采用两者构建的多层散射样品很难在深度方向进行有效分开,本文选用glass来隔断两种不同散射系数的样品(PS微球和Intralipid)实非得已,但由于glass具有非散射特性,采用本文提到的计算方法对glass部分的深度分辨散射系数进行计算不合理,计算的glass部分的散射系数仅反映该位置出现了强烈得反射信号,而不能算作glass部分的散射系数。每层glass的散射系数不一致,第二层glass以下的深度范围较第一层glass更低。由(3)式可知,第二层glass以下的光功率之和较第一层更小,这导致计算的散射系数较第一层glass的更大。同理第三层glass以下的深度范围较第二层glass更低,功率之和更小,计算的散射系数较第二层的更大。因此三层glass的散射系数与第二层不同,总体是随着层数的增加逐渐变大。
关于“在纵向扫描末端,可用于散射系数计算的像素数较少,散射系数的计算误差偏大”这一问题,Omatsud等[27]对纵向扫描末端散射系数的高估作了相应优化,通过拟合系统噪声信号,得到噪声信号的多项式方程,在之后的样本成像过程中,利用该多项式在纵向扫描末端将深度信号扩展至更深的位置。扩展出的部分信号经(3)式计算后可使样品以下的光功率之和增大,因此样品散射系数的计算结果比根据未扩展的深度信号计算的散射系数小。考虑到构建的谱域OCT系统对细胞悬液、细胞负载水凝胶支架的成像深度有限(800 pixel,约为2.8 mm),本文在计算深度分辨散射系数时,对纵向扫描末端的散射系数进行了截取,只显示了纵向1~800 pixel的散射系数分布。
实验中,聚焦点在样品表面时,系统信噪比降低,由于光束在样品内部发生了散焦,背景噪声强,可能导致计算的散射系数偏小。Smith等[28]指出当光束聚焦在样品表面时,聚焦点深度变化不会影响散射系数的测量,但是聚焦在表面,系统信噪比降低可能会导致散射系数测量值偏小。同时,Smith等[28]还指出当聚焦点在散射样本内部时,随着聚焦点的深度加深,由于样品内部的光路散焦问题,聚焦深度加深能量损失增大,测量的信号功率变小,导致散射系数逐渐减小,因此必须考虑共焦函数来防止计算的散射系数不准确。对于细胞悬浮液、细胞负载水凝胶支架等细胞类样品,采用OCT系统探测时,光在样品内部可能发生多次散射。单次散射模型未包含多次散射光的影响,具有一定的局限性;多次散射模型包含了多次散射项,并且考虑了散焦的影响,将多次散射模型与共焦函数相结合,可用于计算更准确的深度分辨散射系数,但多次散射模型的计算解析复杂,需要进一步探索多次散射模型的深度分辨散射系数的解析方法。
表 1. 分布直方图频数峰值处的强度和散射系数及其标准差
Table 1. Intensity and scattering coefficient, and their standard deviation at the peak of frequency of histogram
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利用细胞悬浮液的OCT成像实验验证根据深度分辨散射系数分布图分析细胞浓度的可行性,
生物三维打印细胞负载水凝胶支架是含有水凝胶材料、单细胞、不同大小的细胞团块的多种散射体混合物,细胞的随机分布以及团块的大小等不确定因素导致使用传统整体散射系数计算方式得到的结果不可靠,本文的深度分辨散射系数计算方法不需要在局部分割出均匀区域进行拟合,可以用来检测及量化细胞在水凝胶支架中的分布。生物三维打印支架的OCT强度图像中材料和细胞的灰度相近,容易造成细胞识别出错[
5 结论
本文采用自主搭建的OCT系统对细胞样本进行成像,基于OCT干涉光谱信号计算的深度分辨散射系数量化细胞浓度以及表征生物三维打印支架内的细胞分布。通过自制的多层散射介质模型验证了所提方法的准确性。细胞浓度越高对背景散射的抑制越强,散射系数分布直方图的背景峰和特征峰对应的散射系数之差和细胞浓度具有线性关系。研究发现,通过散射图像能够区分细胞和水凝胶材料,两者之间的散射对比相比强度对比更明显,细胞分布识别更准确,同时采用H&E染色图验证了该方法在细胞分布识别方面的准确性。基于OCT深度分辨散射系数分析方法有望实现三维组织模型中细胞生长情况的无损、实时在线、免标记的检测以及表征。
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沈仁强, 王玲, 徐铭恩, 彭世昌. 基于光学相干层析成像散射量化表征细胞分布的研究[J]. 中国激光, 2020, 47(2): 0207039. Shen Renqiang, Wang Ling, Xu Ming''en, Peng Shichang. Characterization of Cell Distribution Based on Optical Coherence Tomography Scattering[J]. Chinese Journal of Lasers, 2020, 47(2): 0207039.
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