基于显微镜数字图像的荧光免疫层析定量检测方法

李婷婷; 冯大伟; 李琦; 向阳; 贾强; 路雨桐; 赵阳

doi:doi:10.3788/CJL202047.1107001

中国激光, 2020, 47 (11): 1107001, 网络出版: 2020-11-02

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Quantitative Detection Method of Fluorescence Immunochromatography Based on Microscopic Digital Image

论文大纲

李婷婷 ¹冯大伟 ^1,*李琦 ¹向阳 ¹贾强 ²路雨桐 ¹赵阳 ¹

作者单位

¹ 长春理工大学光电工程学院, 吉林长春 130022

² 中国科学院上海光学精密机械研究所空间激光工程技术实验室, 上海 201800

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摘要

荧光免疫层析定量检测技术已被广泛应用于临床检测领域,如新型冠状病毒肺炎的筛查和检测。为了提高检测精准度,提出了基于荧光显微镜数字图像处理的荧光免疫层析定量检测方法。首先构建了显微系统的光通量损失方程,然后根据面阵CCD输出的数字图像特征提取原始图像中的RGB分量并对其进行加权处理,之后拟合了面阵CCD的量子响应速率曲线,获得了荧光信号的相对强度。根据荧光信号强度即可反演出待测物的浓度。实验验证后可知,检测结果的变异系数为3.04%,线性拟合系数大于0.99。本检测方法可对最低质量浓度为0.1 ng/mL的待测物进行准确检测,适用于CCD成像型荧光显微镜系统,对荧光检测具有一定的参考意义。

Abstract

Fluorescence immunochromatographic quantitative detection technology has been widely used in the field of clinical detection, such as for the screening and detection of the new coronavirus pneumonia. To improve the detection accuracy, a fluorescence immunochromatographic quantitative detection method based on fluorescence microscope digital image processing is proposed. Initially, the luminous flux loss equation of the microscopy system is constructed. Then, the RGB components in the original image are extracted according to the digital image features output by the area array CCD, and the quantum response rate curve of the area array CCD is fitted after weighting to compensate. Finally, the relative intensity of the fluorescence signal is obtained, and the concentration of the analyte is inversed according to the intensity of the fluorescence signal. After experimental verification, it can be observed that the coefficient of variation of the test results is 3.04%, and the linear fitting coefficient is >0.99. This detection method can accurately detect the analyte with a minimum mass concentration of 0.1 ng/mL. It is suitable for CCD imaging fluorescent microscope system and has certain reference significance for fluorescence detection.

1 引言

荧光免疫层析试纸检测技术是基于免疫层析技术发展而来的,该技术用荧光标记抗原或抗体,通过检测荧光强度就可以实现待测物浓度的检测^[1-2]。目前,荧光免疫层析定量检测可分为光电检测法和成像式检测法。光电检测法将光电二极管或光电倍增管作为探测器,ESE Quant定量侧向层析检测仪^[3-4]是其中最具代表性的设备。这类分析仪利用步进电机带动试纸条运动,并利用扫描镜头对检测试纸进行扫描,然后将光信号转化为电信号,根据输出的电压值计算被测样品的荧光强度^[5-7]。成像式检测法是在成像系统后利用CCD获取试纸条的荧光图像^[8-10],然后对图像进行处理得到荧光强度信息。2018年,徐笑晗等^[11]利用手持显微镜和CCD设计了荧光免疫层析试条成像检测系统,此系统采用算法提取图像中的荧光面积,然后根据图像的平均灰度值推算荧光强度。光电检测法对机械扫描系统稳定性的要求较高,且容易受背景光的影响。成像式检测方法则忽略了系统的光通量损失,并且将彩色图像整体转化为灰度图像,细分度只有256级^[12-13],对试纸条最低灵敏度的检测精度有待提高。

本文首先利用荧光显微镜系统对荧光物质进行激发和探测,建立显微系统的光通量损失方程,计算待测荧光到达CCD像面过程中的光通量损失,然后基于CCD像元的光电转化特性提取数字图像的RGB分量并对其进行加权处理,最后拟合了面阵CCD的量子响应速率曲线。通过计算补偿后的RGB分量亮度加权值来确定荧光强度,然后就可以反演出待测物的浓度。

2 光通量损失方程的建立

光学系统具有一定的透过率,输出的光通量要比输入的光通量少,光能损失会使光学系统成像的光能量降低。为了获得准确的光强信息,根据几何光学及光度学^[14-15]可得到光学成像系统的数学模型,如图1所示。

图 1. 光学成像系统数学模型示意图

Fig. 1. Schematic of optical system imaging

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当发光面与探测面S不平行时,元发光面的法线n与中心光轴oo'的夹角为α。若元立体角dΩ内发出的光通量为dΦ_V,则发光面的光亮度L_V为

L_{V} = \frac{d Φ_{V}}{\cos α d A d Ω}, (1)

式中: $\frac{d Φ_{V}}{d Ω}$ =I_V,相当于发光面在α方向的发光强度;dA为发光面的元面积。故(1)式所示的光亮度公式可以写成

L_{V} = \frac{I_{V}}{\cos α d A} 。 (2)

透镜C与发光面立体角ω之间的关系为

ω \approx \frac{\frac{π}{4} D'^{2}}{r^{2}} = \frac{π D'^{2}}{4 r^{2}}, (3)

式中:D'为孔径光阑的直径;r为物距。因透镜存在一定的透过率,故而光在传输过程中会产生一定程度的能量损失。根据光的传播规律,探测面S处的光通量Φ_V为

Φ_{V} = I_{V} \times ωτ = L_{V} \cdot cosα \cdot d A \cdot \frac{π D'^{2}}{4 r^{2}} τ, (4)

式中:τ为透镜C的透过率。由几何关系可得

\frac{d A'}{d A \cos α} = \frac{r'^{2}}{r^{2}}, (5)

则探测面dA'的照度E_V为

E_{V} = \frac{Φ_{V}}{d A'} = \frac{π τD'^{2}}{4 r'^{2}} L_{V} 。 (6)

(6)式为光通量损失基本方程。针对荧光显微镜系统的结构特征(发光面与探测面平行,且激发与探测同光路),设计了光学传输模型。根据光通量损失基本方程分析荧光显微系统的光通量损失。图2为检测系统结构示意图。

图 2. 检测系统光学结构示意图

Fig. 2. Schematic of optical structure of detection system

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激发光源采用高压汞灯与窄带滤光片的组合,窄带滤光片的中心波长为365 nm,半带宽为10 nm。激发后的荧光经过二向色镜和阻断滤光片后由CCD接收。考虑到荧光显微镜系统中的二向色镜和阻断滤光片都会使光在传输过程中产生一定的损失,根据光通量损失基本方程,建立了荧光显微系统的光通量损失方程,即

E_{Y} = \frac{π τεγ}{4 f_{m}^{2}} {(1 - \frac{f}{l})}^{2} L_{0}, (7)

式中:E_Y为CCD像面上接收的照度;L₀为荧光亮度;ε为二向色镜的透过率;γ为阻断滤光片的透过率;f为物镜的焦距;l为物镜的物距;f_m为物镜的F数。

在进行检测时,系统中的l及f保持不变,则(7)式中的 $\frac{π τεγ}{4 f_{m}^{2}} {(1 - \frac{f}{l})}^{2}$ 是一个常数。在激发光强度不变的情况下,CCD像面上的照度与检测试纸的荧光亮度呈线性关系,通过确定像面的照度就可以计算出荧光亮度值。通过(7)式可以计算出显微系统在实际检测中的光通量损失,从而能准确计算待测试纸的荧光强度,提升检测准确度。此外,在设计过程中选用透过率高的光学材料可以减少光通量损失。本文检测方法流程图如图3所示。

图 3. 检测方法流程图

Fig. 3. Flow chart of detection method

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3 CCD数字图像的处理方法

本文使用维视图像MV-EM510M/C型工业相机采集荧光信息,表1为CCD的相关参数。

面阵CCD的每一个像元都可以看作是一个光电二极管^[16]。本文所用工业CCD的像元尺寸为3.45 μm×3.45 μm,有效感光面积为8.5 mm×7.1 mm,可以简单地将其看成是由500万个光电二级管组成的面阵探测器。面阵CCD成像原理如图4所示。

表 1. CCD相关参数

Table 1. CCD related parameters

Parameter	Content
Highest resolution	2456×2058
Optical size	2/3
Maximum frame rate /(frame·s^-1)	15
Exposure time /μs	30--5000000
Pixel size /(μm×μm)	3.45×3.45
Photosensitive area /(mm×mm)	8.5×7.1
Data bits	8/14

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图 4. 面阵CCD成像原理示意图。(a) CCD成像原理简图;(b) RGB亮度阶梯

Fig. 4. Schematics of area array CCD imaging. (a) Schematic of CCD imaging principle; (b) RGB brightness ladder

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维视图像MV-EM510M/C型工业相机的拜耳滤光片以BGGR方式排列,图4(a)是成像原理简图。由CCD获得色卡上的数字图像信息,CCD的处理单元对数字图像信息进行空间色彩插值运算^[17],最终输出图像。在图4(b)中可以看到,传感器的亮度值分为256个阶梯,每个RGB通道也可以分为256个亮度阶梯。如果将亮度区间范围加大,就可提高检测的精准度。

利用CCD输出的数字图像信息得到原始图像的RGB分量,然后再对每个RGB像元的亮度值进行统计分析。利用MATLAB统计质量浓度为50 ng/mL尿孕酮标准检测样品的数字图像信息后,就可以计算得到RGB像元亮度直方图,如图5所示。

图 5. RGB像元亮度直方图。(a) R分量像元亮度直方图;(b) G分量像元亮度直方图;(c) B分量像元亮度直方图

Fig. 5. RGB component pixels brightness histogram. (a) R component pixel brightness histogram; (b) G component pixel brightness histogram; (c) B component pixel brightness histogram

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图5(a)为R分量的亮度直方图,纵坐标表示所占的像元数,横坐标表示亮度值,R分量所占的亮度范围在0~40之间,相对亮度较弱。图5(b)与图5(c)分别为G分量和B分量的亮度直方图,其中G分量所占的亮度范围在50~150之间,B分量所占的亮度范围在40~100之间,且相对亮度较强。

为了提升亮度区间范围,将亮度值与像元数做乘积运算,得到RGB分量的亮度加权值,利用加权后的亮度值计算CCD像面上的电子响应亮度值E'_Y。通常使用常规色域系统的数字亮度方程描述RGB信号与亮度信号的关系^[18],即

E'_{Y} = 0.299 E'_{R} + 0.587 E'_{G} + 0.114 E'_{B}, (8)

式中:E'_R、E'_G、E'_B分别为R、G、B分量的亮度加权值。经计算可知E'_R=65.16385×10⁵,E'_G=3973.60052×10⁵,E'_B=3148.34580×10⁵,从而可以得到CCD像面上的电子响应亮度值E'_Y=2170.90190×10⁵。

此外,由于CCD存在一定的量子转化效率,在将光子转化为电子的过程中,接收的光子数和响应的电子数会受到入射波长的影响。为了减小检测误差,需要对CCD像面上的电子响应亮度值进行补偿,其中CCD的量子响应速率曲线如图6所示。

图 6. 量子响应速率曲线

Fig. 6. Quantum response rate curve

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激发后的荧光的中心波长为615 nm,其对应的量子响应速率接近0.8。拟合量子响应速率曲线后,CCD像面上接收的照度E_Y为

E_{Y} = \frac{E'_{Y}}{0.8} 。 (9)

经计算可知E_Y=3388.62737×10⁵,将其代入荧光显微系统的光通量损失方程,可求得荧光亮度L₀。

4 实验结果及分析

常用的免疫荧光层析法有竞争法和夹心法。竞争法的待检分子浓度与荧光强度呈负相关,而夹心法与竞争法相反,待检分子数越多,激发的荧光越强^[19-20]。用竞争法标记的尿孕酮(P)标准样品的荧光免疫反应原理如图7所示。

图 7. 荧光免疫反应原理。(a)待测溶液的制备;(b)试纸结构

Fig. 7. Principle of fluorescence immunity reaction. (a) Preparation of test solution; (b) structure of test paper

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首先需要配制待测溶液,如图7(a)所示。第一步,在烧杯中加入浓度未知的激素代谢物(HM)和浓度已知的单抗(mAb)。为了实现有效检测,确保在试纸检测范围内每个激素代谢物(HM)都可以与单抗(mAb)反应,加入单抗(mAb)的量要与事先固定在试纸检测线上的激素-蛋白结合物(HPC)相等。此时,所有激素代谢物(HM)与单抗抗体(mAb)结合生成激素抗体结合物(HAC)。第二步,在烧杯中加入与单抗(mAb)等量的二抗荧光结合物(SAFC),二抗荧光结合物(SAFC)与第一步反应剩余的单抗抗体(mAb)结合成单抗-二抗-荧光结合物(MAFC);与此同时,二抗荧光结合物(SAFC)与第一步反应生成的激素抗体结合物(HAC)结合,生成激素抗体-二抗-荧光结合物(HASAFC)。

表 2. 拟合结果

Table 2. Fitting result

Item	Our experiment	ESE Quant
Linear expression	y₁=-986.0339x₁+10.9533	y₂=34.37304x₂+0.6281
Linear fit	$R_{1}^{2}$ =0.9986	$R_{2}^{2}$ =0.9963

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图7(b)为标准检测试纸。该试纸可检测的质量浓度范围是0.1~100 ng/mL,试纸的主要结构有样品垫(SP)、结合垫(BP)、层析膜(IM)、检测线T、质控线C、吸水纸(AP)等,其中在检测线T(以下简称“T线”)上事先固定了激素-蛋白结合物(HPC),并对质控线C(以下简称“C线”)进行了荧光标记。将配制好的待测溶液滴在样品垫(SP)上,待测溶液在虹吸力作用下向吸水纸(AP)方向移动。当待测溶液流经T线时,单抗-二抗-荧光结合物(MAFC)会与事先固定在检测线上的激素-蛋白结合物(HPC)结合,其余物质继续向前层析。最后通过检测荧光亮度进行定量检测,荧光亮度值与激素代谢物(HM)的浓度成反比,激素代谢物(HM)的浓度越高,荧光亮度越低。

激素代谢物(HM)的浓度与荧光亮度之间的关系式为

η_{0} = η - \frac{L_{0}}{K_{e}}, (10)

式中:η₀为激素代谢物(HM)的分子数;η为单抗(mAb)的分子数;K_e为发光系数。激素代谢物(HM)的分子数和与之结合的单抗分子数一致,而剩余的单抗分子数可以通过检测T线的荧光亮度获得,因此可以计算得到激素代谢物(HM)的浓度。

第一次实验时,将质量浓度远超100 ng/mL的尿孕酮激素代谢物溶液滴入空白试纸上,C线发光,T线不发光。保持荧光显微镜的光源亮度值恒定,分别检测C线和T线的荧光信号强度,并规定C线和T线的相对荧光信号强度值为100000和0,则激素代谢物(HM)的相对荧光信号强度值在0~100000区间内。

选取12组不同浓度的尿孕酮(P)标准样品滴入空白试纸条上进行检测。根据相对荧光信号强度值与浓度的关系,采用最小二乘法进行线性回归分析,拟合后的数据如图8所示。为了检验测试结果的准确性,将本实验结果与ESE Quant定量侧向层析检测仪的测量结果进行对比。

图 8. 不同浓度尿孕酮(P)分子的荧光信号强度曲线

Fig. 8. Fluorescence signal intensity curves of urine progesterone (P) molecule with different mass concentrations

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图8中的黑色虚线表示ESE Quant定量侧向层析检测仪的检测结果,实线表示本文检测结果。由于将亮度进行了加权处理,扩大了亮度区间,因此,可以明显看出实线上每个采样点的纵坐标相距更远,具有较高的细分度。分析计算后得到的数据拟合结果如表2所示,ESE Quant定量侧向层析检测仪的线性拟合度 $R_{2}^{2}$ =0.9963,本文检测方法的线性拟合度 $R_{1}^{2}$ =0.9986。可见,本文方法得到的激素代谢物(HM)浓度与荧光亮度信号具有更高的线性拟合度。

再选取质量浓度为0.5 ng/mL的尿孕酮(P)标准样品,将其滴在空白试纸条上,在检测条件不变的情况下进行12次检测,得到的数据如图9所示。

图 9. 检测结果

Fig. 9. Test results

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检测结果的变异系数(C_v)为

C_{v} = \frac{σ (X)}{E (X)}, (11)

式中:σ(X)表示样本数据的标准差;E(X)表示样本数据的平均值。经计算可知C_v值为3.04%,满足检测标准。

5 结论

本文介绍了基于荧光显微镜数字图像处理的荧光免疫层析定量检测方法。本文首先构建了显微系统的光通量损失方程,然后对提取的RGB分量进行加权处理,增大亮度区间的范围,之后拟合了面阵CCD的量子响应速率曲线,最后获得了荧光强度值,并根据荧光强度反演出了待测物尿孕酮(P)的浓度。经计算可知检测结果的变异系数为3.04%,相关拟合系数大于0.99。

本文检测方法具有较好的重复性和线性拟合度,对荧光检测具有一定的参考价值。

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1 引言

2 光通量损失方程的建立

图 1. 光学成像系统数学模型示意图

Fig. 1. Schematic of optical system imaging

图 2. 检测系统光学结构示意图

Fig. 2. Schematic of optical structure of detection system

图 3. 检测方法流程图

Fig. 3. Flow chart of detection method

3 CCD数字图像的处理方法

表 1. CCD相关参数

Table 1. CCD related parameters

图 4. 面阵CCD成像原理示意图。(a) CCD成像原理简图;(b) RGB亮度阶梯

Fig. 4. Schematics of area array CCD imaging. (a) Schematic of CCD imaging principle; (b) RGB brightness ladder

图 5. RGB像元亮度直方图。(a) R分量像元亮度直方图;(b) G分量像元亮度直方图;(c) B分量像元亮度直方图

Fig. 5. RGB component pixels brightness histogram. (a) R component pixel brightness histogram; (b) G component pixel brightness histogram; (c) B component pixel brightness histogram

图 6. 量子响应速率曲线

Fig. 6. Quantum response rate curve

4 实验结果及分析

图 7. 荧光免疫反应原理。(a)待测溶液的制备;(b)试纸结构

Fig. 7. Principle of fluorescence immunity reaction. (a) Preparation of test solution; (b) structure of test paper

表 2. 拟合结果

Table 2. Fitting result

图 8. 不同浓度尿孕酮(P)分子的荧光信号强度曲线

Fig. 8. Fluorescence signal intensity curves of urine progesterone (P) molecule with different mass concentrations

图 9. 检测结果

Fig. 9. Test results

5 结论

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1 引言

2 光通量损失方程的建立

图 1. 光学成像系统数学模型示意图

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图 2. 检测系统光学结构示意图

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图 3. 检测方法流程图

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3 CCD数字图像的处理方法

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图 4. 面阵CCD成像原理示意图。(a) CCD成像原理简图;(b) RGB亮度阶梯

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图 5. RGB像元亮度直方图。(a) R分量像元亮度直方图;(b) G分量像元亮度直方图;(c) B分量像元亮度直方图

Fig. 5. RGB component pixels brightness histogram. (a) R component pixel brightness histogram; (b) G component pixel brightness histogram; (c) B component pixel brightness histogram

图 6. 量子响应速率曲线

Fig. 6. Quantum response rate curve

4 实验结果及分析

图 7. 荧光免疫反应原理。(a)待测溶液的制备;(b)试纸结构

Fig. 7. Principle of fluorescence immunity reaction. (a) Preparation of test solution; (b) structure of test paper

表 2. 拟合结果

Table 2. Fitting result

图 8. 不同浓度尿孕酮(P)分子的荧光信号强度曲线

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图 9. 检测结果

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