荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来，经历了多代创新与发展，其空间分辨率已经远超衍射极限，横向分辨率能够达20 nm以下，可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术，并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外，针对分辨率的限制因素，就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨，并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。

超分辨显微技术突破衍射极限的分辨能力为研究纳米尺度的超精细结构和生理学过程提供了有力的观察手段,对研究细胞的功能以及疾病的发病机制有十分重要的影响,具有十分重要的生物医学意义。单分子定位成像技术作为超分辨成像技术的一个分支,具有重大的科研价值。从单分子定位成像技术的研究背景和意义出发,详细介绍了该技术的发展历程,对现有的主要单分子定位技术进行了较为详细的原理介绍和各自优缺点的分析,最后对单分子定位技术的实际应用进行了展望。

由于光学衍射极限的存在,一直以来常规光学显微镜的分辨率被限制在照明光波长的一半左右,这严重限制了生物、材料等研究领域对于更细微结构的观察。共聚焦显微成像技术作为最典型也是最早的点扫描显微技术,凭借其良好的光切片能力和高信噪比成为如今应用最为广泛的光学显微技术。然而由于共聚焦显微成像技术的截止频率有限,分辨率的提升也受到限制。移频技术是将更高频的信息移动到可观察的频率范围,从而提高点扫描显微技术的分辨率。详细介绍了点扫描移频超分辨成像技术的基本原理、优缺点,并对其进行了展望。

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用, 使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像, 本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像, 以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后, 本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明, 在488 nm和640 nm激发光下, 该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率, 另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像, 满足了实际应用的要求。