双光子荧光显微镜作为一种高分辨光学仪器, 已经被广泛应用于生物样品的非侵入式三维光学成像中。 相比共聚焦显微镜, 双光子荧光显微镜拥有更深的探测深度。 然而, 即便如此, 在对较厚的生物样品进行非侵入式光学三维成像时, 样品的成像质量也往往会随着探测深度的增加而下降。 在临床和生物学领域对研究母性遗传起重要作用的小鼠卵母细胞拥有较大的直径(80～100 μm), 吸收和散射效应较为明显。 本文研究小鼠卵母细胞染色体的三维双光子荧光图像随探测深度增加图像质量的衰减程度。 通过对所得图像进行轴向衰减矫正, 利用体积作为参数, 将矫正前后小鼠卵母细胞内染色体三维双光子荧光图像进行对比。 结果表明, 由于吸收和散射效应, 卵母细胞存在较严重的光学轴向衰减问题, 因此, 对用双光子荧光三维成像手段获得的小鼠卵母细胞图像进行衰减矫正是有必要的。 这为进一步精确定量的研究卵母细胞内染色体的三维构像打下良好的基础。

为观测神经营养因子对胞内Ca2+浓度的影响, 将牛视网膜神经细胞内的Ca2+用Fluo-3标记, 用搭建的活细胞实时成像荧光显微系统对其成像, 并观测在脑源性神经营养因子BDNF等四种神经营养因子的作用下细胞内游离Ca2+浓度(［Ca2+］i)随时间的变化的规律。 由于荧光分子有自发衰减效应, 故对得到的细胞内荧光强度采用“去衰减效应修正”的处理方法, 再现了较真实地代表［Ca2+］i的荧光强度。 修正后的数据显示, 加入四种神经因子后, ［Ca2+］i皆有不同程度的升高, 与相关文献所描述的类似实验具有相似结果, 说明此种对活细胞内荧光标记物的实时动态成像的实验方法可行, 去衰减效应修正的数据处理方法可靠。

量子点(QD)具有抗漂白能力强、 量子产率高、 激发谱宽和发射谱窄等优点, 在生物荧光标记领域有较广泛的应用。 利用QD 585和Hoechst 33342 (H342)双标记小鼠卵母细胞中DNA甲基转移酶(Dnmt)和染色体, 通过双光子成像同时双通道探测它们的荧光图像, 获得了Dnmt蛋白表达的三维空间分布。 发现老龄小鼠卵母细胞不适合体外培养成熟: 该成熟方式不仅引起老龄小鼠卵母细胞Dnmt蛋白含量的变化, 而且还改变了它们在胞质中的空间分布。 这些改变可能与异常的甲基化修饰有关。

在像增强型电荷耦合器件(ICCD)荧光显微成像装置上用双通道成像方法观察了非洲绿猴肾细胞(COS-7)中由EGFP转染的肌球蛋白Myosin 15a, 以及Rhodamine标记的细胞微丝。 为观察微丝尖端的肌球蛋白Myosin 15a, 采用了高灵敏、 低损伤的全内反射激发荧光显微成像技术, 并在双通道中选用合适滤光片组合消除两种荧光染料间的光谱串扰。 实验观测到非洲绿猴肾细胞内过表达的肌球蛋白Myosin 15a和伸长的微丝的分布情况, 尤其是清晰观察到Myosin 15a在微丝上的分布。 为全内反射双通道荧光成像技术在生命科学中的应用展示了广阔的前景。

细胞骨架在植物细胞及其运动、 发育变化等过程中起着重要作用。 本文利用MS培养基在无菌条件下培养转染GFP(绿色荧光蛋白)的拟南芥, 使其经过从种子萌发、 植株生长直至开花结果的完整生命周期； 在此过程中, 利用适合对较大较厚样品进行活体四维成像的双光子激光扫描显微术, 观测活的拟南芥种子、 根尖、 导管和根毛等器官内的细胞骨架形态, 以及拟南芥根尖生长发育的动态过程, 量化计算出根尖的生长速度。 用低浓度(10－10mol·L-1)吲哚-3-乙酸刺激拟南芥, 观测到根尖生长速度比正常情况下提高约3.8倍。

全内反射荧光(TIRF)成像技术利用穿透深度仅200 nm左右的隐失波来激发诱导荧光, 探测灵敏度和图像信噪比大大提高, 成为单分子研究的有力工具。 分子梳技术利用DNA末端与固体表面的结合力和周围流体流动产生的侧向力将DNA分子拉伸并平铺在表面上。 结合这两种技术, 对分子梳拉直的单个DNA分子进行了清晰的实时荧光成像, 发现TIRF成像条件下DNA分子与荧光探针YOYO-1组成的复合体可自然避免发生光敏断裂现象; 实时监测了单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白过程, 通过对激发光照射时间与探测器曝光时间进行同步控制, 可大幅降低光漂白程度, 为拉直的单个DNA分子的长时间实时观察和成像研究优化了实验条件, 为实时、 可视化地研究其与蛋白质相互作用的动力学过程奠定了基础。

把基于量子点的DNA纳米传感器模型应用到ICCD荧光显微成像系统中,利用量子点的量子产率高、荧光寿命长、激发谱宽而发射谱窄、发射波长可由材料尺寸调谐等特性,以量子点为供体,Cy5(一种小分子荧光染料)为受体,结合ICCD系统的全内反射荧光成像功能、实时成像功能和双通道成像功能,证实了DNA纳米传感器可以在溶液中检测到含30个碱基的单链目标DNA片段。 实时拍摄了溶液中链霉亲和素包被的量子点对两头分别连着Cy5和生物素的单链DNA片段(Cy5-ssDNA-Biotin)的捕获过程。 并在活的中国仓鼠卵巢细胞样品中加入链霉亲和素包被的量子点和Cy5-ssDNA-Biotin进行实时荧光成像,拍摄到链霉亲和素包被的量子点和Cy5-ssDNA-Biotin进入细胞中并发生FRET的过程,初步表明了DNA纳米传感器在活细胞内进行DNA(或RNA)片段检测的可行性。

利用双波长分光器(Dual-View)和自制滤光片滑块, 在基于像增强型电荷耦合器件(ICCD)的实时/快速荧光成像系统基础上, 建立了一种基于单个ICCD的三通道实时荧光成像方法, 同时发展了相应的图像校准处理方法用于消除光谱串扰的影响, 并将该方法应用于单个活细胞的研究。 利用Annexin V-FITC和SNARF-1两种荧光探针进行双标记, 在单细胞水平上对亚硝基谷胱甘肽(GSNO)诱导小鼠胸腺细胞凋亡与其胞浆pH值变化的关系进行实时研究。 结果揭示了GSNO诱导的细胞凋亡与细胞发生自发凋亡时胞浆pH值有不同的变化规律, 为这种三通道实时荧光成像方法在生物医学领域的应用展示了广阔的前景。