美满霉素(Minocycline, MC)是一种半合成四环素类广谱抗生素, 具有较强的抗菌作用, MC经口服后迅速被吸收, 与血清白蛋白结合率为76%～83%。 研究牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)与 MC之间的结合机理, 有利于在分子层面探讨MC与BSA的相互作用机制, 进一步了解MC与BSA的结构和功能关系, 并为MC的药理毒性、 药效的深入研究提供必要数据支持。 在模拟生理条件和不同的温度条件下, 采用荧光光谱、 圆二色谱、 紫外光谱和分子对接模拟技术研究MC和BSA之间的相互作用及机理。 研究结果表明, MC对BSA的荧光有猝灭作用, 且猝灭常数KSV随温度升高而降低, 说明MC与BSA的猝灭机理为静态猝灭。 利用Stern-Volmer方程和静态猝灭双对数公式对荧光结果进行计算, 结果表明MC与BSA之间的结合位点数n都接近于1。 根据Van’t Hoff热力学方程式在298, 303和308 K下求得热力学参数结果为焓变ΔH=-34.14 kJ·mol-1, 熵变ΔS=32.55 J·(mol·K)-1, 吉布斯自由能ΔG=-43.84 kJ·mol-1(298 K), -43.88 kJ·mol-1(303 K), -44.17 kJ·mol-1 (308 K), 证明二者之间的主要作用力为范德华力和氢键, 其作用过程为自发、 放热过程。 通过MC与BSA的紫外可见吸收光谱分析, 发现BSA的吸收峰位置有明显的红移, 表明BSA的构象发生了变化。 根据Frster’s非辐射能量转移理论得到的MC和BSA的结合距离为r=1.873 nm, 表明在MC和BSA之间发生了非辐射能量转移。 同步荧光光谱的实验结果表明, 当MC和BSA相互作用时, BSA的构象发生了变化, 结合位点位于色氨酸(Trp)残基上。 此外, 三维荧光光谱和圆二色谱分析都进一步表明MC与BSA相互作用时会使BSA的构象变化且BSA中的色氨酸(Trp)残基周围微环境极性减小, 疏水性增强。 通过MC与BSA作用前后圆二色谱二级结构的定量分析可知: BSA中α-螺旋结构占比为31.75%, 逐步加入MC后, α-螺旋结构占比依次变为47.10%(ｃBSA∶ｃTRO=1∶1), 54.39%(ｃBSA∶ｃTRO=1∶5), 说明α-螺旋结构含量占比, BSA的结构以α-螺旋结构为主。 分子对接模拟表明MC结合在BSA的site I(亚域IIA)位置, MC分子与BSA中的氨基酸残基以范德华力结合作用的有: PHE508, LYS535, HIS534, PHE501, GLN579, VAL546, MET547, LEU528, PHE508, 以氢键结合作用的有: LYS524和LEU531, 产生超共轭效应的残基有: ALA527, VAL575, LEU531, PHE508, 这些氨基酸与MC分子紧密结合, MC使BSA的二级结构发生改变。 本实验获得的数据有助于了解MC和BSA的相互作用机制, 同时也有助于了解MC在人体的储运过程中对BSA构象的影响。

用干法制备糖基化产物。 人血清白蛋白(HSA)与葡萄糖质量比1∶1, 溶解混和均匀, 经48 h冷冻干燥, 根据不同反应时间得到20个样本。 旨在联合多光谱学技术(紫外、 荧光、 近红外、 红外和圆二色光谱(CD光谱))分析人血清白蛋白糖基化前后二级三级结构和官能团的变化信息, 以及分析不同反应时间对HSA糖基化产物结构特性的影响。 实验结果表明: HSA与葡萄糖在干热条件下极易发生糖基化反应; 随反应时间延长, 蛋白质紫外吸收强度减弱, 内源荧光吸收强度增强, 糖基化反应增强, 美拉德反应程度提高, 蛋白质二级三级结构相应发生变化。 反应到140 min左右时, 美拉德反应前期糖基化反应完全, 生成Amadori产物, 进一步加热反应到220 min左右, 反应进入中后期, 开始生成醛酮类物质, 反应到280 min左右, 蛋白质氨基酸与羰基化合物发生脱羧、 脱氨反应。

Metacaspases(MCPs)是发现于植物、 真菌、 原生动物体内的一种结构上类似多细胞动物Caspase的半胱氨酸蛋白酶家族, 其大多数成员的激活依赖于钙离子, 但钙离子如何影响MCPs的激活机制有待深入研究。 借助圆二色谱技术、 Terbium/Stains-all探针技术以及荧光光谱技术, 以番茄Ⅱ型Metacaspase(LeMCA1)重要位点突变的三种体外原核表达重组蛋白, 包括LeMCA1C139A(活性催化位点突变体)、 LeMCA1K223G(自降解位点突变体)以及预测的Ca2+结合位点突变体LeMCA1D116A/D117A为研究材料, 探究了MCPs与Ca2+ 相互作用机制。 实验结果表明, Ca2+与LeMCA1之间既不存在强烈的结合作用, 也不影响蛋白的二级结构, 但Ca2+通过相互作用改变LeMCA1的三级结构来实现对LeMCA1的酶原激活过程。 其中, LeMCA1蛋白的Asp-116, Asp-117氨基酸残基作为预测的与Ca2+作用的重要位点, 其缺失将导致蛋白与Ca2+相互作用能力下降。 利用圆二色谱、 荧光光谱结合离子探针技术研究了典型茄科植物番茄中Ca2+与LeMCA1的相互作用特性, 结合之前同源序列比对、 位点突变结果确定了LeMCA1中的Asp-116, Asp-117氨基酸残基影响着Ca2+与蛋白质的相互作用。 该结果对后续LeMCA1的生化特性及晶体结构的解析研究有着重要的参考价值。