氨基硫脲过渡金属配合物的生物学应用是当前研究的热点, 为更好地了解氨基硫脲芳基钌配合物与人血清白蛋白(HSA)之间相互作用机制, 合成了两种氨基硫脲芳基钌(Ⅱ)配合物, 采用时间分辨荧光光谱法和稳态荧光光谱法研究了两种氨基硫脲芳基钌配合物与人血清白蛋白的荧光猝灭机理。 荧光光谱结果表明, 这两种氨基硫脲芳基钌配合物能使HSA的内源荧光猝灭, 且HSA的荧光猝灭影响与配合物的浓度呈线性关系, 通过对比发现配合物2对HSA的荧光猝灭效率更强。 两个配合物与HSA相互作用的猝灭常数和结合常数均随温度的升高而降低, 因此, 配合物与HSA的相互作用是静态猝灭过程, 且配合物2的荧光猝灭能力更强。 通过热力学参数分析发现这两种配合物与HSA的主要结合作用力均为氢键和范德华力, 且两种配合物与HSA之间的结合过程是自发进行的。 最后采用红外吸收光谱及圆二色光谱验证了这两种氨基硫脲芳基钌配合物均对HSA二级构象产生了不同程度的影响, 红外吸收光谱结果表明两种配合物与HSA的结合引起了HSA二级结构的重排, 圆二色光谱结果表明这两种配合物的加入使HSA的二级结构稳定性降低。 研究表明: 通过探究氨基硫脲芳基钌配合物对人血清白蛋白结构和功能的影响, 可揭示其作为抗肿瘤药物进入体内后与HSA的可能作用机制, 从而为以氨基硫脲为配体的芳基钌配合物类抗肿瘤药物的研发提供理论参考。

华法林作为口服维生素K拮抗剂几十年来广泛应用于治疗血栓类疾病。 因此针对华法林的物理化学性质的研究成为了人们的重点。 通过含时密度泛函理论(TD-DFT), 模拟了华法林分子在水溶液状态下与人血清蛋白结合过程中几种状态的紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)与荧光光谱, 研究不同状态在激发过程中的跃迁方式和电荷转移过程, 以及光谱的差异, 探究整个动力学过程的激发态变化机理。 结果表明, 华法林在水溶液中紫外-可见吸收光谱表现出双吸收现象, 双吸收现象主要由不同的激发态跃迁导致。 未去质子化前, 主要吸收峰波长为291 nm, 去质子化后, 吸收强度降低, 波长红移, 当华法林与血清蛋白结合后发生电荷转移导致吸收增益, 波长307 nm吸收峰强度最高。 通过计算第一激发态(S1)的结构和激发能模拟华法林不同状态的荧光光谱, 最初状态下荧光峰为360 nm, 去质子化后, 荧光强度降低, 波长红移, 结合后结构变化导致荧光增益。 根据华法林的荧光光谱变化情况, 说明其在整个动力学过程中存在不同的荧光发射过程。 通过分子前线轨道分析和电子-空穴分析研究整个动力学过程的电荷转移情况, 表明华法林单体的荧光发射过程为局域激发, 与蛋白质结合后荧光发射过程为电荷转移激发, 结合后的荧光增益特征使华法林可以作为荧光探针。 该研究揭示了华法林与蛋白结合过程中光谱变化机理, 为以后探究分子结合动力学过程提供新型研究手段和理论支撑。

Human serum albumin (HSA) is the most abundant protein in plasma and plays an essential physiological role in the human body. Ethanol precipitation is the most widely used way to obtain HSA, and pH and ethanol are crucial factors affecting the process. In this study, infrared (IR) spectroscopy and near-infrared (NIR) spectroscopy in combination with chemometrics were used to investigate the changes in the secondary structure and hydration of HSA at acidic pH (5.6–3.2) and isoelectric pH when ethanol concentration was varied from 0% to 40% as a perturbation. IR spectroscopy combined with the two-dimensional correlation spectroscopy (2DCOS) analysis for acid pH system proved that the secondary structure of HSA changed significantly when pH was around 4.5. What’s more, the IR spectroscopy and 2DCOS analysis showed different secondary structure forms under different ethanol concentrations at the isoelectric pH. For the hydration effect analysis, NIR spectroscopy combined with the McCabe–Fisher method and aquaphotomics showed that the free hydrogen-bonded water fluctuates dynamically, with ethanol at 0–20% enhancing the hydrogen-bonded water clusters, while weak hydrogen-bonded water clusters were formed when the ethanol concentration increased continuously from 20% to 30%. These measurements provide new insights into the structural changes and changes in the hydration behavior of HSA, revealing the dynamic process of protein purification, and providing a theoretical basis for the selection of HSA alcoholic precipitation process parameters, as well as for further studies of complex biological systems.

近年来, 卟啉及金属卟啉在光动力疗法、 抗癌药物研究方面备受关注, 有些已被批准临床使用。 人血清白蛋白(HSA)能结合、 运输许多药物活性分子, 详细研究金属卟啉与HSA的结合机制, 对阐明卟啉类药物的作用机制具有重要的意义。 研究合成了3种新型6-氯烟酸修饰的自由卟啉(4, 5, 6)及锌卟啉(4-Zn, 5-Zn, 6-Zn), 并通过测试表征和理论计算的方法进行了结构确定。 理论计算结果表明: 3种锌卟啉中的侧链6-氯烟酸基团均远离卟啉环平面; 4-Zn构型比连有取代基的5-Zn、 6-Zn构型更稳定。 在模拟生理条件下, 采用荧光光谱法研究了3种锌卟啉与HSA之间的键合方式, 通过Stern-Volmer方程、 双对数方程和Van’t Hoff方程对测定结果进行计算。 结果表明: (1)3种锌卟啉均能有效猝灭HSA的荧光, Stern-Volmer方程计算得到锌卟啉与HSA在不同温度下的Kq值均大于2.0×1010 L·mol-1·s-1, 表明猝灭类型为静态猝灭; (2)采用双对数方程得到锌卟啉与HSA的结合常数, 除5-Zn在318 K时外, 其他温度条件下的结合常数KA均大于103 L·mol-1, 结合位点数n均接近1, 说明形成了1∶1的复合物; (3)根据Van’t Hoff方程计算, 3种锌卟啉与HSA结合的热力学参数均小于0, 如4-Zn与HSA结合的热力学参数为ΔH=-123.9 kJ·mol-1, ΔS=-322.9 J·mol-1·K-1, ΔG=-27.7 kJ·mol-1(298 K), 由此得出反应过程为自发进行, 反应的主要作用力为范德华力和氢键。 实验获得的数据可以为研究金属卟啉与生物小分子的作用机制提供一些有用的信息。

近年来, 纳米材料对环境和人类健康的潜在风险已经引起了人们的广泛关注。 纳米颗粒尺寸小、 反应活性高, 当其进入机体后很可能与体内的生物大分子相互作用, 使其原来的理化性质发生改变, 更容易被细胞识别、 吞噬, 进而对组织、 器官等产生危害; 作用过程中生物大分子也会受到纳米颗粒的影响, 可能导致其生理结构受到损伤, 并干扰其特定功能的正常执行; 因此研究纳米材料与蛋白质的相互作用对探究其生物安全性具有重要意义。 实验通过多种光谱手段研究了碳量子点（CQDs）对人血清白蛋白（HSA）结构与功能性质的影响以及两者的相互作用机制。 荧光光谱与紫外-可见吸收光谱结果显示, CQDs通过与HSA结合形成复合物导致蛋白质荧光猝灭; 结合常数KA与结合位点数n的计算结果表明CQDs在HSA上只有一个结合位点, 且同步荧光和位点竞争实验发现, 这个结合位点接近HSA中ⅡA亚结构域上的色氨酸残基; 根据Frster共振能量转移(FRET)理论计算出两者的作用距离r=2.89 nm<8 nm, 表明HSA与CQDs之间通过非辐射能量转移导致蛋白质内源性荧光猝灭; 根据Van’t Hoff方程计算得到HSA-CQDs体系的热力学参数, 由热力学参数计算结果推断相互作用过程中主要有氢键和范德华力参与; 根据共振光散射（RLS）、 三维荧光光谱和圆二色光谱（CD）结果显示, 相互作用会导致HSA的二级、 三级结构发生改变, 蛋白质中α-螺旋结构含量增加, HSA进一步卷曲折叠, 使色氨酸残基所处微环境的疏水性增大; 而结构变化还进一步影响着蛋白质的聚集状态和一些生理功能, 使得相互作用后HSA的聚集程度和类酯酶活性降低, 不利于蛋白质的团聚, 自由基清除能力略有提高。 该研究可为纳米材料的生物与环境安全评价提供参考依据, 也为探究纳米颗粒-蛋白质相互作用提供了一套较为系统的光谱分析方法。

茶多酚与抗肿瘤药物联用具有增效、 减毒以及逆转耐药性的作用, 可作为生化调节剂应用于临床。 通过荧光光谱、 紫外-可见吸收光谱、 圆二色光谱和动态光散射研究了柔红霉素 (DNR) 与人血清白蛋白 (HSA) 在模拟生理条件下的相互作用以及表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) 对DNR与HSA结合过程的影响。 通过MTT法测定了DNR单一药物、 EGCG+DNR组合药物及其与HSA的复合物对人宫颈癌HeLa细胞系的细胞毒性。 荧光猝灭结果与紫外-可见吸收差谱表明DNR与HSA之间形成静态复合物。 由荧光数据拟合得到猝灭常数、 结合常数、 结合位点数、 焓变和熵变。 正的焓变和熵变表明DNR与HSA的结合过程主要为熵驱动, 且疏水作用为结合过程的主要驱动力。 位点标记竞争实验结合同步荧光光谱表明, DNR主要结合在HSA的IIA结构域, 并且更接近色氨酸残基。 在HSA+EGCG+DNR三元体系中, 建立了三元体系的荧光数据处理模型, 并用Matlab拟合得到EGCG存在下DNR与HSA相互作用的结合位点数与结合常数均明显减小, 表明EGCG的存在降低了DNR与HSA的亲和力。 此外, 在EGCG存在下, DNR与HSA作用的结合常数随着温度升高而增加, 表明结合过程的主要作用力仍为疏水作用。 圆二色光谱和动态光散射研究表明药物与蛋白结合会影响蛋白的构象和粒径, 导致HSA的α-螺旋含量减小且粒径增加。 EGCG存在的(HSA+EGCG)+DNR三元体系中的α-螺旋含量大于相应的HSA+DNR二元体系中的α-螺旋含量, 而三元体系的水合粒径相对于二元体系的有所减小。 这均表明EGCG与DNR存在竞争结合, EGCG的存在使DNR与HSA的结合减弱, 与三元体系的荧光实验结果一致。 此外, 讨论了EGCG对DNR和HSA+DNR复合物的细胞毒性的影响, 结果表明DNR与EGCG具有协同作用且HSA可以增强DNR的细胞毒性。 所得结果可为EGCG与DNR在临床中的联合应用提供有益信息。 研究表明光谱方法可为联合药物与蛋白的相互作用研究提供有力支撑。

五环三萜化合物齐墩果酸(OA)与熊果酸(UA)为同分异构体, 具有相似的理化性质和稍有差异的药理活性。 目前人们主要采用各种色谱、 质谱类方法实现对OA与UA的异构体识别, 未见使用荧光光谱法的报道。 提出了一种使用荧光猝灭法实现对OA与UA异构体识别的方法。 首先考察了两种常见的血清蛋白—牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HSA)同OA与UA的作用情况, 结果表明OA与UA均可有效地猝灭BSA与HSA的荧光发射。 对所得荧光猝灭数据计算可知OA, UA与BSA, HSA作用的双分子猝灭速率常数(Kq)均远大于生物大分子荧光猝灭所观察到的最大散射碰撞速率常数2.0×1010 L·(mol·s)-1, 说明猝灭类型均为静态猝灭, 即OA与UA均是通过与BSA及HSA形成稳定复合物方式实现荧光猝灭的。 应用双对数方程对所得荧光猝灭数据计算可知OA, UA与BSA, HSA所形成的复合物中结合位点数在0.90～1.26之间, 说明所形成的复合物为1∶1型。 BSA与OA, UA所形成复合物的表观结合常数(KA)为同一数量级, 相差不大, 但是HSA与OA, UA所形成复合物的KA差别很大, HSA-UA复合物的KA比HSA-OA复合物高124.91倍, 表明HSA-UA复合物的稳定性更强。 同步荧光实验结果显示, OA与UA的加入对于HSA波长差(Δλ)为60 nm同步荧光光谱的影响大于Δλ为15 nm的同步荧光光谱, 由此可以说明OA与UA在HSA上的结合位点可能位于Trp残基附近。 分子对接模拟计算结果表明OA与UA均对接在HSA结构中一个疏水性空腔中, 主客体之间存在强烈的氢键与疏水作用。 OA同Arg218, His242, Pro447等残基间存在氢键作用, 键长分别为2.95, 2.97与3.17 , 此外还与Lys195, Lys199, Trp214, Arg222, Leu238, Asp451和Tyr452等七个氨基酸残基间存在疏水作用。 UA同Trp214, Arg218和Lys444等残基存在氢键作用, 键长分别为3.01, 2.88与2.65 , 此外还与Leu198, Gln221, Arg222, Asn295, Val343, Pro447, Cys448, Asp451和Val455等9个氨基酸残基间存在疏水作用。 由于UA同HSA作用位点数目多于OA, 说明UA与HSA疏水性空腔的空间匹配程度更高。 因此, 认为HSA-UA与HSA-OA复合物间稳定性差异是HSA实现对OA与UA异构体识别的原因。

日落黄是一种具有潜在危害性的人工合成色素。 选用人血清蛋白为研究对象, 利用荧光光谱法分析了日落黄对人血清蛋白荧光的猝灭作用, 确定了荧光猝灭反应的猝灭常数Ksv, 结果表明日落黄对人血清蛋白的荧光猝灭作用类型为静态猝灭。 运用同步荧光光谱法分析日落黄与人血清蛋白结合表明: 日落黄与人血清蛋白的结合靠近色氨酸附近, 引发色氨酸残基趋向伸展状态, 人血清蛋白的结构发生改变。 此外, 在模拟人体生理条件下选用10种不同的金属离子加入到日落黄和人血清蛋白的反应体系中, 运用三维荧光法检测金属离子对体系的影响, 结果表明Cu2+, Pb2+, Ni2+和Mn2+对猝灭过程有着促进作用, 其中Ni2+的影响最大, 增幅达 22.6 %; 而Fe2+和Zn2+对猝灭过程有着抑制作用, 抑制率达14.12%和14.2%。 本研究的实验方法适用于研究食品添加剂的毒性, 有助于保护食品安全, 维护人体健康。

用干法制备糖基化产物。 人血清白蛋白(HSA)与葡萄糖质量比1∶1, 溶解混和均匀, 经48 h冷冻干燥, 根据不同反应时间得到20个样本。 旨在联合多光谱学技术(紫外、 荧光、 近红外、 红外和圆二色光谱(CD光谱))分析人血清白蛋白糖基化前后二级三级结构和官能团的变化信息, 以及分析不同反应时间对HSA糖基化产物结构特性的影响。 实验结果表明: HSA与葡萄糖在干热条件下极易发生糖基化反应; 随反应时间延长, 蛋白质紫外吸收强度减弱, 内源荧光吸收强度增强, 糖基化反应增强, 美拉德反应程度提高, 蛋白质二级三级结构相应发生变化。 反应到140 min左右时, 美拉德反应前期糖基化反应完全, 生成Amadori产物, 进一步加热反应到220 min左右, 反应进入中后期, 开始生成醛酮类物质, 反应到280 min左右, 蛋白质氨基酸与羰基化合物发生脱羧、 脱氨反应。