美满霉素(Minocycline, MC)是一种半合成四环素类广谱抗生素, 具有较强的抗菌作用, MC经口服后迅速被吸收, 与血清白蛋白结合率为76%～83%。 研究牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)与 MC之间的结合机理, 有利于在分子层面探讨MC与BSA的相互作用机制, 进一步了解MC与BSA的结构和功能关系, 并为MC的药理毒性、 药效的深入研究提供必要数据支持。 在模拟生理条件和不同的温度条件下, 采用荧光光谱、 圆二色谱、 紫外光谱和分子对接模拟技术研究MC和BSA之间的相互作用及机理。 研究结果表明, MC对BSA的荧光有猝灭作用, 且猝灭常数KSV随温度升高而降低, 说明MC与BSA的猝灭机理为静态猝灭。 利用Stern-Volmer方程和静态猝灭双对数公式对荧光结果进行计算, 结果表明MC与BSA之间的结合位点数n都接近于1。 根据Van’t Hoff热力学方程式在298, 303和308 K下求得热力学参数结果为焓变ΔH=-34.14 kJ·mol-1, 熵变ΔS=32.55 J·(mol·K)-1, 吉布斯自由能ΔG=-43.84 kJ·mol-1(298 K), -43.88 kJ·mol-1(303 K), -44.17 kJ·mol-1 (308 K), 证明二者之间的主要作用力为范德华力和氢键, 其作用过程为自发、 放热过程。 通过MC与BSA的紫外可见吸收光谱分析, 发现BSA的吸收峰位置有明显的红移, 表明BSA的构象发生了变化。 根据Frster’s非辐射能量转移理论得到的MC和BSA的结合距离为r=1.873 nm, 表明在MC和BSA之间发生了非辐射能量转移。 同步荧光光谱的实验结果表明, 当MC和BSA相互作用时, BSA的构象发生了变化, 结合位点位于色氨酸(Trp)残基上。 此外, 三维荧光光谱和圆二色谱分析都进一步表明MC与BSA相互作用时会使BSA的构象变化且BSA中的色氨酸(Trp)残基周围微环境极性减小, 疏水性增强。 通过MC与BSA作用前后圆二色谱二级结构的定量分析可知: BSA中α-螺旋结构占比为31.75%, 逐步加入MC后, α-螺旋结构占比依次变为47.10%(ｃBSA∶ｃTRO=1∶1), 54.39%(ｃBSA∶ｃTRO=1∶5), 说明α-螺旋结构含量占比, BSA的结构以α-螺旋结构为主。 分子对接模拟表明MC结合在BSA的site I(亚域IIA)位置, MC分子与BSA中的氨基酸残基以范德华力结合作用的有: PHE508, LYS535, HIS534, PHE501, GLN579, VAL546, MET547, LEU528, PHE508, 以氢键结合作用的有: LYS524和LEU531, 产生超共轭效应的残基有: ALA527, VAL575, LEU531, PHE508, 这些氨基酸与MC分子紧密结合, MC使BSA的二级结构发生改变。 本实验获得的数据有助于了解MC和BSA的相互作用机制, 同时也有助于了解MC在人体的储运过程中对BSA构象的影响。

近年来, 随着对红曲色素的深入研究, 其越来越多的功能活性被发现, 但其某些致毒作用也使红曲色素的安全性受到了质疑。 因此, 阐明红曲色素在人体中与大分子的相互作用对深入研究其转运代谢及毒副作用具有重要作用。 光谱法是研究溶液中小分子与蛋白质相互作用的一种有效方法, 其具有灵敏度高、 选择性强、 用样量少、 方法简单等优点, 在研究中得到越来越广泛的应用。 为探究红曲色素在体内的转运机制和血液中与转运蛋白的相互作用, 本研究首次用红斑红曲胺(Rubropunctamine, Rub)作为红曲色素的典型代表与牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)相互作用。 利用内源荧光光谱、 同步荧光光谱探究不同浓度的Rub对BSA的荧光猝灭作用, 采用Stern-Volmer方程、 Lineweaver-Burk函数和Van’t-Hoff方程对不同温度下BSA与Rub作用后在λEX/λEM(280.0 nm/340.0 nm)(λEX/λEM表示荧光的激发波长和发射波长)的内源荧光强度值确定二者作用类型、 结合位点数及相互作用机理, 进一步利用圆二色谱定量测定了Rub的结合对BSA二级结构影响, 最后运用软件Discovery Studio2.5对Rub与BSA的相互结合进行分子对接模拟。 结果显示: (1) Rub对BSA具有较强的内源荧光猝灭效果, 在λEX/λEM(280.0 nm/340.0 nm)的荧光强度下降306.1, 发射波长由338.6 nm蓝移到331.8 nm, 同步荧光显示荧光猝灭主要发生在色氨酸残基上。 (2)Stern-Volmer方程计算得到动态猝灭速率常数Kq为2.335×1012 L·(mol·s)-1, 远大于此类型允许的最大扩散碰撞常数2.0×1010 L·(mol·s)-1, 判定该猝灭是单纯的静态猝灭过程。 利用Lineweaver-Burk函数计算得到静态猝灭速率常数Kq随温度升高而减小, 即该复合物在温度升高时变得不稳定。 (3)利用等式lg［(F0－F)/F］=lgK0＋nlgcQ得到两者结合常数可达103 L·mol-1以上, 结合位点数近似为1, 且随着温度增加表观结合常数变小。 (4)不同温度下Van’t-Hoff方程计算得到ΔH, ΔS, ΔG都小于0, 则该相互作用能自发进行且氢键和范德华力是其主要的相互作用力。 (5)圆二色谱测得BSA与Rub结合后二级结构中α-螺旋含量由29.4%降至20.2%; β-折叠由39.9%上升到50.7%; β-转角由6.5%下降到3.5%; 无规则卷曲由24.2%上升到25.6%。 (6)分子对接发现Rub结合点位于 BSA中由Arg458, Asp108, Glu424和Ser428等氨基酸形成的口袋内, 与Arg458有范德华力作用, 与Arg144形成分子内氢键, 影响到Trp213微环境。

采用傅里叶红外光谱仪(FTIR)和振动圆二色谱仪(VCD)测量氧化槐果碱固体的红外光谱和振动圆二色谱。 采用密度泛函方法(DFT)分别在B3LYP/cc-PVTZ和B3LYP/6-311+G(d, p)水平下, 对气相中氧化槐果碱分子结构进行了优化, 然后在相同水平下计算了氧化槐果碱的红外光谱(IR)以及振动圆二色谱(VCD)。 将实验谱图与理论计算谱图进行对照, 以确定氧化槐果碱的实际构象以及构象分布。 由对比结果可知: 采用B3LYP/6-311+G(d,p)水平下, 以吉布斯自由能进行玻尔兹曼加权平均后的理论IR和VCD谱图与实际光谱图最为接近, 说明在常温下氧化槐果碱具有A/B-trans C/D-trans和A/B-trans C/D-cis两种优势构象, 且玻尔兹曼分布显示两种构象均以一定比例共存, 且通过对氧化槐果碱的两种优势构象分析, 发现A/B环的立体结构为: 椅式-椅式, C/D环的立体结构为: 椅式-沙发式。

基于微流控混合器, 采用连续流探测方法, 在北京同步辐射装置真空紫外光谱实验站发展了毫秒动态圆二色谱探测方法。 石英微流控混合器采用深度离子刻蚀技术加工, 通道深度445 μm。 混合器采用蛇形通道实现溶液的快速混合。 通过荧光倒置显微镜, 在模拟真实实验条件的高粘度溶液中, 观察蛇形通道内溶液混合的荧光图像, 进行混合效率测试。 500 μL·min-1流量下, 目前可实现45～270 μs的时间尺度探测。 利用微流控混合器进行动态探测, 同步辐射紫外光必须聚焦, 但由于聚焦透镜波长色散引起的焦点位移, 导致圆二色谱发生畸变。 通过精确测试不同波长对应焦点的相对位置, 然后在圆二色谱扫描中实现波长和焦点位置精确的反馈控制, 获得准确的圆二色谱。 利用所发展的方法, 测试了去折叠状态下的细胞色素c恢复折叠的动态同步辐射圆二色谱, 在45 μs处折叠恢复54%。 这种方法将为生物大分子折叠动力学研究提供新的探测手段。

聚赖氨酸是一种重要的聚阳离子, 在生物医药领域具有广泛的应用前景。 但是, 目前其血液相容性的相关报道较少, 特别是通过光谱法研究其与血液中重要蛋白的相互作用。 因此, 通过多种光谱法研究聚赖氨酸与纤维蛋白原的相互作用, 进一步评价其血液相容性具有一定的创新性。 本实验通过荧光、 紫外和圆二色谱研究聚赖氨酸对纤维蛋白原结构的影响。 其中, 聚赖氨酸的正电性随着浓度增大而增大; 复合实验显示, 0.01 mg·mL-1的聚赖氨酸对纤维蛋白原的功能影响较小, 随着浓度增大, 相互作用增强; 荧光光谱显示, 纤维蛋白原在λem=341 nm处出现浓度依赖性的荧光猝灭; 紫外光谱显示, 聚赖氨酸对纤维蛋白原吸收强度（200～240和278 nm处）的影响在0.025 mg·mL-1时较小, 并出现浓度依赖性的减少; 圆二色光谱显示, 随着聚赖氨酸浓度增大, 纤维蛋白原的α-螺旋含量减少, β-折叠、 β-转角和无规卷曲含量增加。 结果表明, 聚赖氨酸会与纤维蛋白原发生静电相互作用, 对其结构造成浓度依赖性的影响。 当浓度为0.01和0.025 mg·mL-1时, 聚赖氨酸对纤维蛋白原结构的影响较小; 而浓度过大时, 影响较大, 势必破坏纤维蛋白原的生理功能。 因此, 研发和应用聚赖氨酸时必须充分考虑浓度因素。 本实验提供了一种简便而系统的方法来研究材料与蛋白的作用,有利于充分评价材料的血液相容性。 此外, 上述研究结果对聚赖氨酸的生物医学应用具有重要的指导意义。

全氟十二酸(PFDoA)是8～12个碳链的全氟烷酸(PFAAs)中毒性最强的新型环境污染物。 已有大量研究表明PFAAs在环境中广泛积累, 但对PFDoA与HSA的相互作用还处于起步阶段。 本研究力争在模拟生理条件下, 采用荧光猝灭法、 分子模拟技术和圆二色谱确定HSA与PFDoA的相互作用机理。 研究结果表明, PFDoA对HSA的猝灭是动态猝灭与形成PFDoA-HSA基态复合物引起的猝灭共同作用的结果。 计算得到的结合距离(r=3.65 nm)表明, PFDoA(受体)与HSA(供体)之间的相互作用发生了非辐射能量转移。 取代反应结果表明, PFDoA键合在HSA的site Ⅰ位点上。 分子对接进一步研究了PFDoA与HSA作用的详细结合情况, 表明PFDoA通过多种作用力结合在HSA的亚域IIA内, 例如, PFDoA上的O 1原子主要通过极性键与HSA上的Arg 257和Ser 287残基结合。 计算得到的最优对接能量为-25.87 kJ·mol-1, 表明PFDoA对HSA有较大的结合亲和力。 同步荧光光谱和三维荧光光谱研究了PFDoA对HSA构象的影响, 结果显示, 与PFDoA结合后, 色氨酸的微环境疏水性增加, HSA的构象也发生改变。 PFDoA与HSA作用前后圆二色谱二级结构的定量分析结果表明, PFDoA-HSA复合物的形成使螺旋稳定性降低。 该研究结果为全氟烷酸与HSA的动力学研究提供了理论依据和可靠数据, 并揭示了生物大分子与配体相互作用的化学本质。

纳米材料与蛋白质等生物大分子的相互作用是纳米材料生物效应和安全性研究的重要基础。 本实验利用荧光光谱、 同步荧光光谱、 圆二色谱(CD)等方法研究了四种结构特性不同的水溶性羧基化碳纳米管(long-SWCNTs-COOH, short-SWCNTs-COOH, DWCNTs-COOH, MWCNTs-COOH)与人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)的相互作用。 实验结果显示: 四种水溶性羧基碳纳米管均能猝灭HSA的内源荧光, 但猝灭能力有所不同, 相同浓度下不同水溶性羧基化碳纳米管对HSA的荧光猝灭作用遵循如下规律: DWCNTs-COOH＜MWCNTs-COOH＜long-SWCTs-COOH＜short-SWCNTs-COOH; 四种碳纳米管对HSA的同步荧光光谱影响表明, MWCNTs-COOH的作用位点更靠近色氨酸(Trp)残基, 而DWCNTs-COOH的作用位点更靠近酪氨酸(Tyr)残基, 而long-SWCNTs-COOH和short-SWCNTs-COOH对两种氨基酸残基的作用无明显差别; 在碳纳米管作用下, HSA 的圆二色谱有微弱的变化, 且与α-螺旋、 β-折叠含量变化基本一致。 结果表明, 不同碳纳米管对HSA的荧光猝灭能力与它们的结构特性有关, 两者作用过程中HSA构象基本不变, 二级结构有微小变化, 但无明显的剂量-效应关系。 根据实验结果对可能的作用机制进行了讨论。

窄分子量分布低聚壳聚糖CSn(n表示壳聚糖的聚合度, n=6, 8, 11)和对二甲氨基苯甲醛(DMABA)通过缩合反应得到了新型的基于壳聚糖的希夫碱化合物DMABA-CSn。 利用荧光光谱法, 同步荧光光谱法, 圆二色谱法(CD)和等温滴定微量热法(ITC)研究了DMABA-CSn与牛血清白蛋白 (BSA)之间的相互作用。 通过荧光光谱法探讨了DMABA-CSn对BSA的荧光猝灭机制。 结果表明, DMABA-CSn(n=6, 8, 11) 均能使BSA的荧光猝灭, 猝灭机制是形成DMABA-CSn/BSA复合物的静态猝灭。 利用同步荧光光谱法和圆二色谱法考察了DMABA-CSn对BSA构象的影响。 研究结果表明, BSA的构象在DMABA-CSn的溶液微环境中发生了变化。 另外, ITC热力学测定结果(ΔH<0, ΔS<0, ΔG<0)表明, BSA与DMABA-CSn的作用过程是自发进行的放热过程, 二者之间的作用力类型主要是氢键和疏水作用。 同时, 研究结果也说明在一定的分子量范围内, 随着CSn聚合度的增加, DMABA-CSn更容易与BSA结合。 研究结果为DMABA-CSn(n=6, 8, 11)作为潜在药物的药理作用机制研究提供了一定的理论参考。

利用内源性荧光光谱、 荧光探针(ANS)结合荧光光谱及圆二色谱, 以乳白蛋白-油酸为参照, 研究了乳白蛋白结合亚油酸后, 疏水性氨基酸、 疏水性区域、 三级结构及二级结构的变化, 并利用亚甲基蓝的方法评价了该复合物的抗肿瘤活性。 荧光光谱结果显示, 与乳白蛋白-油酸复合物类似, 乳白蛋白结合亚油酸后, 其内源性荧光光谱显著红移, 从331.07 nm移至337.60 nm; 外源性ANS结合光谱蓝移, 从516.20 nm移至508.50 nm; 且荧光强度增加, 表明乳白蛋白结合亚油酸后同样出现了疏水性氨基酸及疏水性区域暴露的现象。 圆二色谱结果表明, 与乳白蛋白-油酸复合物类似, 乳白蛋白结合亚油酸后, 三级结构部分丧失, 二级结构中β-转角及无规卷曲的含量显著降低, β-折叠含量增加。 细胞实验证实了乳白蛋白-亚油酸复合物具有良好的抗肿瘤效果。 该研究从复合物结构和功能的两方面, 为新型抗肿瘤乳白蛋白-亚油酸复合物的开发提供了依据。

Metacaspases(MCPs)是发现于植物、 真菌、 原生动物体内的一种结构上类似多细胞动物Caspase的半胱氨酸蛋白酶家族, 其大多数成员的激活依赖于钙离子, 但钙离子如何影响MCPs的激活机制有待深入研究。 借助圆二色谱技术、 Terbium/Stains-all探针技术以及荧光光谱技术, 以番茄Ⅱ型Metacaspase(LeMCA1)重要位点突变的三种体外原核表达重组蛋白, 包括LeMCA1C139A(活性催化位点突变体)、 LeMCA1K223G(自降解位点突变体)以及预测的Ca2+结合位点突变体LeMCA1D116A/D117A为研究材料, 探究了MCPs与Ca2+ 相互作用机制。 实验结果表明, Ca2+与LeMCA1之间既不存在强烈的结合作用, 也不影响蛋白的二级结构, 但Ca2+通过相互作用改变LeMCA1的三级结构来实现对LeMCA1的酶原激活过程。 其中, LeMCA1蛋白的Asp-116, Asp-117氨基酸残基作为预测的与Ca2+作用的重要位点, 其缺失将导致蛋白与Ca2+相互作用能力下降。 利用圆二色谱、 荧光光谱结合离子探针技术研究了典型茄科植物番茄中Ca2+与LeMCA1的相互作用特性, 结合之前同源序列比对、 位点突变结果确定了LeMCA1中的Asp-116, Asp-117氨基酸残基影响着Ca2+与蛋白质的相互作用。 该结果对后续LeMCA1的生化特性及晶体结构的解析研究有着重要的参考价值。