深圳大学物理与光电工程学院教育部/广东省光电子器件与系统重点实验室，广东 深圳 518060
荧光寿命显微成像（FLIM）常用来检测活细胞内荧光基团的寿命信息，以实现微观定量分析。荧光共振能量转移（FRET）可用来表征能量从供体荧光分子到受体荧光分子的传递过程。将FLIM技术与FRET结合（FLIM-FRET），可以监测活细胞中蛋白质的相互作用、亚细胞器的动态过程等。构建了以细胞膜上转染的绿色荧光蛋白（sfGFP）为供体、以阿霉素（DOX）为受体的FRET纳米体系，利用双光子激发荧光寿命显微成像（TP-FLIM）系统，通过监测FRET纳米体系中供体荧光寿命的变化，研究了药物DOX在细胞中的递送机制和运输效率。此外，进一步采用四种内吞途径抑制剂，对纳米药物的内吞途径进行了评估。结果证明，牛血清白蛋白（BSA）包裹的DOX（BSA-DOX）纳米颗粒通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。揭示了BSA-DOX纳米颗粒通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞的动态过程。研究表明，FLIM-FRET技术结合定量分析方法可用于区分小分子药物和纳米颗粒与细胞作用的异同。
生物光学 荧光共振能量转移 荧光寿命 细胞膜
1 北京工业大学环境与生命学部, 环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室, 北京 100124
2 中国检验检疫科学研究院, 北京 100123
基于纳米金团簇(AuNCs)良好的光学稳定性、 生物相容性和简单无毒的制备方法, 开发了一种具有高度选择性、 高灵敏度且可视化的尿酸(UA)传感器。 使用牛血清白蛋白(BSA)作为模板合成了BSA-AuNCs。 在尿酸氧化酶的催化下, UA产生化学计量的过氧化氢(H2O2), 导致AuNCs的荧光猝灭。 此外, 发现BSA-AuNCs在该体系模拟过氧化物酶发挥酶活性, 它可以催化产物H2O2将底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)氧化成ox-TMB, 此时BSA-AuNCs的发射光谱与ox-TMB的吸收光谱重叠, 发生了一种荧光共振能量转移(FRET)。 BSA-AuNCs作为供体将激发能量转移到受体ox-TMB, 使ox-TMB产生荧光, 同时BSA-AuNCs的荧光强度明显低于单独存在时的强度, 从而大大提高了UA检测的灵敏度。 在最佳条件下, 发现UA浓度在2~100 μmol·L-1猝灭程度线性关系良好, 线性方程为(F0-F)/F0=0.005 85cUA+0.103 64, 线性相关系数为0.995 4, UA的检出限为0.26 μmol·L-1, 远低于正常人体UA水平的最低限(90 μmol·L-1), 同时研究了血液样本中UA的加标回收, 回收率在97.3%~104.7%, 表明了该方法在临床血样UA的检测中具有很大的应用潜力, 为进一步的临床分析提供了良好的理论依据和方法学指导。
纳米金团簇 尿酸 过氧化氢 荧光共振能量转移 Gold nanoclusters Uric acid Hydrogen peroxide Fluorescence resonance energy transfer
1 华南师范大学生物光子学研究院教育部激光生命科学重点实验室, 广东 广州 510631
2 华南师范大学生物光子学研究院广东省激光生命科学重点实验室, 广东 广州 510631
3 师大瑞利光电科技(清远)有限公司, 广东 清远 511517
基于受体敏化的3-cube(通道)荧光共振能量转移(FRET)成像方法(通常称为E-FRET方法)是活细胞定量FRET检测中主流的成像分析技术。基于激发发射光谱线性分离的定量FRET检测方法(mExEm-spFRET)因天然地克服光谱串扰的能力,在活细胞定量FRET检测中具备非常好的鲁棒性。利用表达不同模型质粒的乳腺癌MCF-7活细胞,在不同信噪比(RSN)的条件下分别进行了定量E-FRET和mExEm-spFRET测量,以FRET效率(E)和质粒供受体浓度比(RC)参量作为指标,评估二种方法的鲁棒性。对于RSN>3的细胞,两种方法得到一致的E值,但是E-FRET方法得到的个别质粒RC值偏小;对于RSN<3的细胞,两种方法都能得到一致的RC值,但是E-FRET方法得到的个别质粒E值误差率大于0.1,与文献值偏差稍大。E-FRET与mExEm-spFRET具有几乎一致的活细胞定量FRET检测能力,但是mExEm-spFRET的鲁棒性优于E-FRET方法。
光谱学 荧光共振能量转移(FRET) 定量FRET测量 活细胞 光谱线性分离 鲁棒性 中国激光
2021, 48(21): 2107001
1 深圳大学生命与海洋科学学院, 广东省植物表观遗传学重点实验室, 广东 深圳 518060
2 深圳大学龙华生物产业创新研究院, 广东 深圳 518060
3 深圳大学物理与光电工程学院, 广东 深圳 518060
细胞是动植物结构和生命活动的基本单位。 细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系。 然而, 利用传统的生化方法（如酵母双杂交系统、 pull-down系统等）很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用。 光学技术的快速发展, 为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具, 其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM）技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势, 如: 实现对活细胞的实时“可视化”研究, 同时具有高时空分辨率; 检测更加灵敏、 结果可信度高; 且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序。 介绍FRET-FLIM技术的理论背景知识, 对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊, 同时归纳了其在蛋白相互作用、 细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展, 最后总结和讨论了FRET-FLIM技术的未来发展趋势, 以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解。
荧光共振能量转移 荧光寿命显微成像 蛋白相互作用 疾病诊断 Fluorescence resonance energy transfer (FRET) Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) Protein interaction Disease diagnosis 光谱学与光谱分析
2021, 41(4): 1023
Author Affiliations
Abstract
1 Nanyang Technological University, School of Electrical and Electronic Engineering, Singapore
2 CINTRA UMI CNRS/NTU/THALES, Singapore
3 Nanyang Technological University, School of Chemical and Biomedical Engineering, Singapore
Optical barcodes have demonstrated a great potential in multiplexed bioassays and cell tracking for their distinctive spectral fingerprints. The vast majority of optical barcodes were designed to identify a specific target by fluorescence emission spectra, without being able to characterize dynamic changes in response to analytes through time. To overcome these limitations, the concept of the bioresponsive dynamic photonic barcode was proposed by exploiting interfacial energy transfer between a microdroplet cavity and binding molecules. Whispering-gallery modes resulting from cavity-enhanced energy transfer were therefore converted into photonic barcodes to identify binding activities, in which more than trillions of distinctive barcodes could be generated by a single droplet. Dynamic spectral barcoding was achieved by a significant improvement in terms of signal-to-noise ratio upon binding to target molecules. Theoretical studies and experiments were conducted to elucidate the effect of different cavity sizes and analyte concentrations. Time-resolved fluorescence lifetime was implemented to investigate the role of radiative and non-radiative energy transfer. Finally, microdroplet photonic barcodes were employed in biodetection to exhibit great potential in fulfilling biomedical applications.
whispering-gallery modes optical barcodes fluorescence resonance energy transfer molecular sensing biointerface cavity-enhancement Advanced Photonics
2020, 2(6): 066002
1 河北大学化学与环境科学学院, 药物化学与分子诊断省部共建教育部重点实验室, 河北 保定 071002
2 河北大学综合实验中心, 河北 保定 071002
利用以阳离子共轭聚合物为能量供体的荧光共振能量转移（FRET）策略和滚环扩增放大技术, 建立了一种新型的microRNA（miRNA）检测方法。 阳离子共轭聚合物采用聚［（9,9-双（6’-N,N,N-三乙基铵）己基）亚芴基亚苯基二溴化物］（PFP）。 PFP是一种由大量吸光单元共轭而成的阳离子聚合物, 具有独特的光捕获和荧光增强性能, 可以和带有负电荷的DNA通过静电作用相互结合。 SG是一种能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的染料, 其在游离状态下, 荧光微弱, 但一旦与双链DNA结合后, 荧光会大大的增强。 首先, 设计了一条可与目标分子特异性杂交的锁式探针和与RCA产物序列互补的DNA链。 当体系中存在miRNA时, 在T4 DNA连接酶作用下, 锁式探针连接成环； 随后, 在phi29 DNA聚合酶和dNTPs共同作用下, 在miRNA的3’端滚环扩增出一条与锁式探针序列互补的长单链DNA, 所得产物与互补DNA链杂交形成双链DNA（dsDNA）。 此时SG作为FRET受体掺入其中, 形成SG-dsDNA共同体。 随后, SG-dsDNA与PFP因静电相互作用而紧密接近, 由于PFP的发射光谱与SG的激发光谱有重叠, 因此二者之间可以发生FRET现象。 反之, 当体系中不存在miRNA时, 挂锁探针则无法连接成环, 阻止了扩增反应的进行及其产物与互补DNA链的杂交反应。 加入SG后, 由于SG与单链DNA的结合能力很弱, SG则游离于溶液中, 不会与PFP发生有效的FRET。 因此目标分子的浓度与体系的FRET效率直接相关。 以let 7a作为待测miRNA分子, 在0.05～5 nmol·L-1的范围内, let 7a的浓度与从反应体系测得的FRET效率（I520/I423）成正比。 同时以无PFP参加的检测方案作为对比实验, 证明了PFP确实具有提高灵敏度的作用。 另外, 以四种同族miRNA分子及两种其他miRNA分子作为干扰物质对方法的特异性进行了考察, 发现除了两种与目标分子序列高度相似的物质存在干扰外, 其他物质几乎不产生信号。 利用该方法对细胞总RNA提取液中let 7a的含量及其加标含量进行了检测, 测量所得回收率基本令人满意。 所建立的方案不需要荧光标记探针, 有效降低了检测成本, 简化了操作步骤, 在与miRNA相关的疾病诊断领域具有一定的应用前景。
无标记 荧光共振能量转移 Label-free microRNA MicroRNA Fluorescence resonance energy transfer
1 华南师范大学生物光子学研究院教育部激光生命科学重点实验室, 广东 广州 510631
2 华南师范大学生物光子学研究院广东省激光生命科学重点实验室, 广东 广州 510631
由于天然克服光谱串扰的能力以及高灵敏和无损伤的特性,基于光谱分离的荧光共振能量转移(FRET)定量检测(spFRET)方法被公认为是最有应用潜力的活细胞定量FRET检测技术。首先简要介绍FRET定量检测方法以及国内外的相关研究进展;其次重点介绍基于发射光谱线性分离(Em-unmixing)和基于激发发射光谱线性分离(ExEm-unmixing)的两种定量FRET检测技术的原理、发展进程,并比较了这两种检测技术的稳健性;最后对这两种spFRET技术在活细胞FRET应用中的潜在优势进行展望。
生物光学 荧光共振能量转移 光谱分离 定量荧光共振能量转移测量 活细胞
1 中国人民解放军军事科学院 防化研究院, 北京 102205
2 国民核生化防护国家重点实验室, 北京 102205
3 中国科学院 理化技术研究所, 北京 100190
实验设计制备了一种由12层硫化锌包覆硒化镉的核壳型量子点(CdSe/12ZnS QDs)和纳米金颗粒(Au NPs)自组装形成的CdSe/12ZnS QDs/Au NPs复合结构, 并将其应用于神经性毒剂模拟剂氰基磷酸二乙酯(Diethyl Cyanophosphonate, DCNP)的高效检测。QDs由于与Au NPs存在荧光共振能量转移作用(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)而发生荧光猝灭, 乙酰胆碱酯酶(AChE)水解氯化硫代乙酰胆碱(ATC)生成的硫胆碱能够将量子点取代而使量子点荧光恢复。当QDs与Au NPs的摩尔浓度比为20 : 1时, QDs荧光猝灭效果最佳, AChE浓度为1.0×10 -3 U/L时, QDs荧光恢复效果最好。DCNP的存在会抑制AChE的活性, 减少硫胆碱的生成并降低QDs的荧光恢复效率, 通过对QDs荧光恢复效率测定能够检测DCNP。在最优条件下对DCNP的检测结果表明, 量子点的荧光恢复效率与DCNP浓度的对数在5.0×10 -9~5.0×10 -4mol/L的范围内存在良好的线性关系, 检出限达5.0×10 -9mol/L。
量子点 纳米金颗粒 神经性毒剂模拟剂 荧光共振能量转移 quantum dots gold nanoparticles nerve agents mimic fluorescence resonance energy transfer
Author Affiliations
Abstract
Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Guangdong Province, College of Physics and Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen, 518060, P. R. China
With the development of the new detection methods and the function of fluorescent molecule, researchers hope to further explore the internal mechanisms of organisms, monitor changes in the intracellular microenvironment, and dynamic processes of molecular interactions in cells. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) describes the energy transfer process between donor fluorescent molecules and acceptor fluorescent molecules. It is an important means to detect protein-protein interactions and protein conformation changes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) enables noninvasive measurement of the fluorescence lifetime of fluorescent particles in vivo. The FRET-FLIM technology, which is use FLIM to quantify and analyze FRET, enables real-time monitoring of dynamic changes of proteins in biological cells and analysis of protein interaction mechanisms. The distance between donor and acceptor and their respective fluorescent lifetime, which are of great importance for studying the mechanism of intracellular activity can be obtained by data analysis and algorithm fitting.
Fluorescence resonance energy transfer fluorescence-lifetime imaging microscopy protein-protein interaction Journal of Innovative Optical Health Sciences
2019, 12(5): 1930010
上海理工大学光电信息与计算机工程学院, 上海 200093
为了减弱金属基底对表面增强荧光的淬灭效应, 设计了增强效果更好的荧光增强基底。采用化学生长二氧化硅的方法对纳米多孔金 (NPG)表面进行修饰, 避免荧光分子和 NPG表面直接接触引起的淬灭效应, 在 SiO2@NPG表面分别组装上罗丹明 6G(R6G)和辐射中心波长为 700 nm的量子点 (QD 700)。通过探测分析荧光光谱, 可以得出: 二氧化硅包覆的基底可以使表面增强荧光得到显著的增强, 并且二氧化硅厚度对荧光强度有调节作用; 在基底增强量子点荧光信号的同时, 量子点和 NPG之间还出现非辐射的能量转移现象, 二氧化硅的厚度对能量转移同样有调节作用, 厚度约为 5 nm时能量转移现象最显著。本实验为基于荧光能量转移的检测以及设计更好的荧光增强基底提供了参考。
纳米多孔金 (NPG) 量子点 表面增强效应 荧光共振能量转移 nanoporous gold (NPG) SiO2@NPG SiO2@NPG quantum dot (QD) surface enhanced fluorescence fluorescence resonance energy transfer
