激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是一种高分辨率的光学成像仪器，它利用“共轭成像”原理，获得的图片质量远超于普通荧光显微镜。LSCM有两组功能不同的针孔，即照明针孔和探测针孔，这是实现“共轭成像”的关键。由于照明针孔的大小和位置一般是固定的，LSCM主要通过调节探测针孔的大小来获得高质量的成像图片。然而，很多使用者对于LSCM中针孔大小与荧光成像质量的关联缺乏了解。因此，本文阐述了针孔在LSCM中的作用原理及其与显微镜分辨率的关系，并通过小鼠脊髓腹侧白质中的免疫荧光成像分析，发现针孔参数优化对提高LSCM荧光成像质量具有显著影响。这一发现将为LSCM成像分析提供重要参考。

测量技术正不断向着精密化、智能化、集成化的方向发展, 具有代表性的光谱共焦测量技术是在激光共焦显微技术的基础上发展而来, 利用色散原理和光谱仪解码分析实现高精度测量。光谱共焦测量技术可进行位移测量、三维重建、表面粗糙度检测和厚度检测, 具有无接触、高效率、在线测量等优点, 在精密测量中发挥着重要作用, 被广泛应用于微电子、工程材料、生物医学和航空航天等领域。近年来, 光谱共焦系统在光学系统结构、光学镜头设计、光源优化和数据处理算法等各个方面取得了重大进展。文章对光谱共焦测量技术进行综述, 论述了光谱共焦测量技术相较于其他测量方法的优势, 综述了光谱共焦技术的测量原理、发展历程与应用进展, 并对光谱共焦测量技术的发展趋势进行了展望。

本文以亚心形扁藻为样品, 波长1 341 nm的Nd∶YAP激光为光源, 通过激光共聚焦扫描显微技术, 研究Nd∶YAP激光辐照亚心形扁藻对亚心形扁藻叶绿体自体荧光强度和叶绿体面积大小的影响。Nd∶YAP激光辐照后的亚心形扁藻通过488 nm Ar+激光激发获得亚心形扁藻自体荧光图像及其荧光光谱。结果表明,试验中除(10 W, 60 s)辐照剂量组外, 其余辐照剂量组均提高了亚心形扁藻的自体荧光强度, 且所有的辐照剂量组均增大了亚心形扁藻的叶绿体面积。Nd∶YAP激光可刺激亚心形扁藻的叶绿体发育, 促进藻细胞的生长, 改善叶绿体光合作用的活性。

为了解决常规选择性激活方法无法与激光扫描共焦显微镜共用扫描光路,难以与成像光路同轴的问题,提出一种同轴扫描式实时光刺激系统,使用现场可编程门阵列控制声光调制器,以调制激光扫描共焦显微镜的成像光源,经成像光路扫描后,刺激输出和成像扫描实现同步;该系统采用Xilinx KC705开发板中现场可编程门阵列集成的外设部件互连标准硬核,采用外设部件互连标准接口将上位机的刺激图像传输到现场可编程门阵列。测试结果表明,所提系统可以满足传输要求,能有效调节光刺激区域。

To investigate the effect of Myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) on apoptosis induced by ischemic/reperfusion (I/R), middle cerebral artery occlusion /reperfusion (MCAO/R) in rats were applied to mimic I/R. The neurological deficit score, cerebral infarct size, cortical neuron apoptosis and cleaved caspase 3 level were evaluated to determine the effect and the level of apoptosis by TTC straining, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) straining, Western blot and immunofluorescence staining. The myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) expression, release of cytochrome C (Cyt C) and its colocalization with apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Western blot, and immunofluorescence staining. The results showed that MRTF-A overexpression could decrease the neurological deficit score and reduce cerebral infarct size (P < 0.01 versus Sham). In the MRTF-A-I/R group, TUNEL-positive cells and apoptosis ratio (%) (51.61 ± 6.17%) were significantly decreased compared to the Neg-I/R group (76.45 ± 8.77%) at 24 h reperfusion. Meanwhile, the cleaved caspase 3 expression revealed a similar trend while the expression of Mcl-1 was the opposite. Moreover, MRTF-A overexpression significantly enhanced Mcl-1 fluorescence intensity, which up-regulated the mRNA and protein level (P < 0.05 or P < 0.01 versus Neg-I/R). Furthermore, MRTF-A overexpression markedly inhibited the release of Cyt C, and decreased the colocalization with Apaf-1 in the cytoplasm (P < 0.05 or P < 0.01 versus Neg-I/R). All the data indicated that MRTF-A overexpression could improve the neurological function against cerebral I/R-induced apoptosis since underlying mechanism might be involved in the Mcl-1/Cyt C/cleaved caspase 3 signaling pathway.

为了合理评定激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)的测量性能, 提出了一种用于检验LSCM计量特性的测试方法。首先, 依据LSCM成像原理, 对其技术特点, 特别是轴向分辨率和横向分辨率等进行了理论分析; 然后对其计量特性的参数指标进行了归纳, 并提出相应的性能测试方法。具体包括采用线间隔为微纳米级的网格板等作为标准器, 测试LSCM的放大倍数和光学横向分辨率; 采用纳米级高度台阶样板测试LSCM的光学轴向分辨率和轴向定位特性; 采用激光干涉仪测试样品台工作性能等。实验证明: 该方法能够满足当前普遍应用的LSCM的性能测试需求。

本文以华中农业大学园艺植物教育部重点实验室细胞生物学实验平台现有的一套由德国徕卡公司生产的新型号TCS-SP8激光共聚焦扫描显微镜机组(文中简称SP8)为例, 结合实际操作经验, 从机组组成使用、软件的使用、使用中常见问题、用后维护及保养等方面进行了大量总结和探索, 希望能够为初次使用仪器者及致力于该领域的科研工作者提供第一手直观详实易懂的操作规程。

分析和比对钙结合蛋白CIB1在人类、大鼠、小鼠中氨基酸序列差异, 并研究CIB1蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位情况。通过Western Blot分析发现293T细胞本身几乎检测不到CIB1的表达。进一步采用CIB1外源性质粒转染, 通过免疫荧光分析实验, 在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间293T细胞中CIB1的表达情况及亚细胞定位变化。实验结果表明, 随着转染时间的增加, CIB1在293T细胞中的表达有逐渐增强的趋势, 并且发生从细胞核向细胞质的转位现象。该实验结果对了解CIB1亚细胞定位变化及功能研究具有重要参考价值。

脱氧核糖核酸(DNA)是染色体的重要组成部分,是一种主要的遗传物质,很多实验方法与理论模型被用来研究DNA与一些重要生物物种相互作用引起的构象变化。采用激光扫描共聚焦表面等离子体共振(LSCISPR)系统研究了一种特定单链DNA(ssDNA)分别与其互补DNA(cDNA)和汞离子(Hg2+)作用后的构象变化。将一端有荧光分子的 ssDNA修饰在表面等离子体共振系统传感芯片上,通过观察荧光图像的变化来确定ssDNA与cDNA及Hg2+之间相互作用而导致的构象变化,并通过动力学曲线计算出二者的结合速率分别为3.33×10-5 s-1和1.42×10-4 s-1。对于ssDNAcDNA的相互作用,荧光图像没有变化。对于ssDNAHg2+的相互作用,在通入Hg2+后荧光发生猝灭。这些结果表明,激光扫描共聚焦表面等离子体共振系统在高灵敏实时监测ssDNA与其他特殊生物分子作用产生的构象变化和计算动力学参数方面有着广阔的应用前景。