双光子荧光显微成像是一种非线性光学显微技术，具有高空间分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点。传统的双光子荧光显微成像通常使用波长可调谐的100 fs超短脉冲激光器作为激光光源。目前，人们对双光子荧光显微成像方法进行了深入研究，改进光源及探测方法是常用的手段。介绍和总结了多色双光子荧光显微成像技术的近期研究进展及其在生物医学中的应用。首先介绍了传统飞秒激光器及光学参量振荡器在多色成像中的应用，然后对光纤超连续谱在多色显微成像中的应用进行了分析，最后简要说明了增强自相位调制效应产生连续光谱以及选择性激发实现多色成像的工作。多色双光子成像技术不仅可以同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度双光子荧光图像，而且具有系统结构简单、操作简便等优点，这使得其在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景，并且为生物医学诊断与研究提供了一种有效的工具和平台。