利用宽带飞秒振荡器作为激发光源搭建了双光子荧光显微成像系统, 在飞秒脉冲的宽带激发下, 测量了罗丹明B溶液的双光子荧光光谱, 开展了罗丹明B固体样品的双光子荧光显微成像研究。在双光子荧光显微成像研究中, 通过调节激发脉冲的功率, 分析了双光子荧光强度和激发脉冲功率之间的关系, 并且利用半波片改变线偏振激发光场的偏振方向, 研究了双光子荧光强度随激发脉冲偏振方向的变化趋势, 实现了双光子荧光强度的类正弦调制。

双光子荧光显微成像是一种非线性光学显微技术，具有高空间分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点。传统的双光子荧光显微成像通常使用波长可调谐的100 fs超短脉冲激光器作为激光光源。目前，人们对双光子荧光显微成像方法进行了深入研究，改进光源及探测方法是常用的手段。介绍和总结了多色双光子荧光显微成像技术的近期研究进展及其在生物医学中的应用。首先介绍了传统飞秒激光器及光学参量振荡器在多色成像中的应用，然后对光纤超连续谱在多色显微成像中的应用进行了分析，最后简要说明了增强自相位调制效应产生连续光谱以及选择性激发实现多色成像的工作。多色双光子成像技术不仅可以同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度双光子荧光图像，而且具有系统结构简单、操作简便等优点，这使得其在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景，并且为生物医学诊断与研究提供了一种有效的工具和平台。

在飞秒激光随机扫描双光子显微成像系统中使用宽带二维声光偏转器扫描飞秒激光, 可以增大扫描角度至74 mrad, 增大双光子显微成像范围。但宽带二维声光偏转器在大角度扫描时引入的色散较大, 造成成像范围边缘的光斑严重畸变, 边缘光斑直径达2.3 μm, 影响边缘视场的成像质量。为了提高成像质量, 设计了一种新的色散补偿方法, 基于衍射透镜组成的开普勒望远系统, 可以同时补偿不同扫描角度的不同色散。经过色散补偿后成像边缘的光斑直径小于1 μm, 使系统获得大范围扫描成像的同时, 所有扫描角度的色散都能够得到很好的补偿, 在整个视场范围内光斑直径小于1 μm, 实现更均匀的荧光激发, 均匀成像。

为解决双光子荧光显微成像系统轴向扫描问题, 提出一种基于数字微镜(DMD)的快速轴向扫描系统。该系统采用DMD选择光路, 不同光路放置不同焦距的透镜组对光束发散角产生不同的改变, 经物镜聚焦后得到不同深度的轴上扫描点。对该系统的轴向扫描距离、扫描点位置及衍射效率进行了理论计算仿真, 结果表明: 扫描系统采用4个模块以及5个模块时其轴向扫描距离均可达到1 mm, 4模块系统中透镜的焦距为297.3 mm, 5模块系统中透镜焦距为361.47 mm。轴向扫描点除边缘点外线性分布,轴向扫描频率达到几十kHz, 满足脑神经成像的要求。

采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌缺血模型,通过双光子荧光显微成像技术(TPEF)获取左心室前壁不同缺血时间的图象,得到心肌在不同缺血时间情况下的双光子荧光图像及其光谱图像。从荧光图像中得到不同时刻形态学信息及心肌细胞代谢信息;从光谱图像中分析心肌缺血组织物质成分。