双光子荧光显微成像是一种非线性光学显微技术，具有高空间分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点。传统的双光子荧光显微成像通常使用波长可调谐的100 fs超短脉冲激光器作为激光光源。目前，人们对双光子荧光显微成像方法进行了深入研究，改进光源及探测方法是常用的手段。介绍和总结了多色双光子荧光显微成像技术的近期研究进展及其在生物医学中的应用。首先介绍了传统飞秒激光器及光学参量振荡器在多色成像中的应用，然后对光纤超连续谱在多色显微成像中的应用进行了分析，最后简要说明了增强自相位调制效应产生连续光谱以及选择性激发实现多色成像的工作。多色双光子成像技术不仅可以同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度双光子荧光图像，而且具有系统结构简单、操作简便等优点，这使得其在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景，并且为生物医学诊断与研究提供了一种有效的工具和平台。

采用共沉淀法制备了一系列Al2O3含量由低到高的ZrO2-Al2O3固溶体, 并研究了固溶体的晶相结构以及稀土Er3+在固溶体中的上转换发光增强机制。 XRD结果表明固溶体为四方晶相ZrO2结构, Al2O3的最高固溶度约为20 mol%。 上转换发光光谱分析表明, Er3+掺杂ZrO2室温下具有绿色上转换荧光发射, 通过共掺杂Yb3+和Mo6+离子, 使得Er3+掺杂ZrO2的绿色上转换发光强度增强了约20倍, 获得了明亮的黄绿色上转换发光。 基质ZrO2通过与Al2O3固溶形成复合氧化物, 由于产生的大量氧空位缺陷的能级与Er3+的4F7/2能级高度相接近, 增强了Yb3+-MoO2-4基团(2F7/2, 3T2)能级向Er3+的4F7/2能级的能量传递。 通过形成固溶体复合氧化物基质材料, 使得Er3+的绿色上转换发光在获得20倍增强的基础上又提高了8倍。 绿色与红色上转换发光比例的变化也提高了材料的色纯度, 上转换发光由黄绿色变为纯绿色。

光学分子成像是在复杂生物体中同时描述多种分子和细胞功能的最佳手段。作为机体发挥防御、监视和自稳功能的免疫系统，研究者们正面临着如何将其作为一个真正的系统来研究的挑战。免疫光子学是指基于光子学原理和方法的活体免疫光学成像和免疫光子治疗。以多光子激发显微成像和光声层析成像为代表的高时空分辨活体成像技术，以荧光蛋白为代表的活体长时程标记方法，使得光学分子成像成为引导免疫学研究走向系统化与可视化道路的主力军。本文从免疫学的特点出发，介绍活体光学成像技术和分子探针的发展，综述其在免疫学研究中的应用，并展望免疫光子学今后的发展方向。

β淀粉样肽(amyloid β-peptide,Aβ)在阿尔茨海默病(Alzheimeir's disease,AD)患者脑内的异常产生和积累在AD的发病机理中扮演着重要的角色.β-分泌酶对淀粉样前体蛋白的裂解是Aβ产生的关键步骤,因此抑制β-分泌酶的活性成为AD药物治疗的一个重要策略.为了检测β-分泌酶的活性,应用基因工程技术将β-分泌酶作用底物序列(NFEV)的两端分别与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的颜色突变体一青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)相连,构建了一个基于GFP的荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针.荧光光谱分析结果显示,该荧光融合蛋白中CFP和YFP之间存在着较强的FRET.而当与β-分泌酶进行孵育后,FRET逐步降低,证明该探针能被β-分泌酶酶切.SDS-PAGE分析显示探针与β-分泌酶孵育后,荧光融合蛋白由60 kD大小逐渐变成30kD大小的蛋白,表明探针被β-分泌酶酶切成CFP和YFP分子,证实了荧光光谱的结果.这些结果表明,可通过检测探针的FRET效率方便地分析β-分泌酶的活性,为进一步筛选β-分泌酶的抑制剂提供了一个平台.

目的:应用光学成像方法检测HSV-tk/GCV自杀基因系统与重组改造的人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necrosis factor,rmhTNF)的联合使用,对人涎腺腺样囊性癌细胞(adenoid cystic carcinoma,ACC-M)的杀伤效率.方法:实验分为四组,细胞模型对照组、单纯HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗组、rmhTNF处理组、自杀基因联合rmhTNF治疗组.将稳定表达胸苷激酶-绿色荧光蛋白(thymidine kinase-green fluorescen protenin,tk-GFP)的ACC-M细胞(ACC-M-tk-GFP)按5 000个/孔接种到96孔板中,24 h后给药治疗;分别于加药前、给药后6 h、给药后24 h进行荧光成像.检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光用于准确显示胸苷激酶(tk)基因表达的肿瘤细胞,检测碘化丙啶(propidium iodide,PI)的荧光用于显示死亡的肿瘤细胞.通过细胞的透射图及其PI和GFP荧光图像,分别计算tk+细胞和tk-细胞的死亡率.结果:HSV-tk/GCV自杀基因系统与rmhTNF联合治疗组的细胞在加药后6 h就已经出现细胞死亡迹象,而单纯HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗组的细胞在加更昔洛韦(ganciclovir,GCV)后24 h才出现细胞死亡,单纯rmhTNF治疗组在加药后24 h还没有细胞死亡发生.对于给药后24 h的tk+细胞死亡率,联合治疗组(85.88%)明显高于GCV(38.13%)和rmhTNF单独治疗组(2.97%),并且联合治疗组给药24 h后会引发部分tk-细胞死亡(9.83%).结论:HSV-tk/GCV自杀基因系统与rmhTNF联合治疗具有显著的协同抗肿瘤效应,能够明显提高对肿瘤细胞的杀伤率;结合光学成像方法,能为更直观方便地检测各组药物分别对tk+细胞和tk-细胞的杀伤率,可为深入研究"旁观者效应"提供参考.

目的:探讨不同的光动力剂量下光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)对体外培养的铜绿假单胞杆菌的杀伤效应.方法:以耐药性较强的铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginos,P.aeruginosa)为研究对象,采用亚甲基蓝(methylene blue,MB)作为光敏剂,用656 nm的激光作为光源(maxoutput=300 mW),对不同系列浓度的MB进行不同剂量的光照,用菌落计数的办法来观测PDT对铜绿假单胞杆菌的杀伤作用;同时利用血培养基检测铜绿假单胞杆菌致病性的改变.结果:在光照剂量相同的情况下,浓度适中(131.7 mol)的亚甲基蓝溶液能够有效地杀伤铜绿假单胞杆菌,使其致病性降低;而浓度较高(1 317 mol)或较低(13.17 mol)的亚甲基蓝溶液对铜绿假单胞杆菌的杀伤作用相对较弱.结论:光动力作用对体外培养的铜绿假单胞杆菌具有明确的杀伤作用,但是其效果和剂量关系密切,所以在治疗过程中必须寻找合适的光敏剂剂量.

激光散斑衬比成像(LSCI)技术作为一种高时空分辨的血流流速分布监测技术,无需扫描即可实时地全场记录微循环血流的时空变化特性。鸡胚尿囊膜(CAM)是用于在体研究光动力治疗(PDT)血管损伤效应的理想动物模型。以发育10天鸡胚尿囊膜为模型,使用光敏剂焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide acid, pyro-acid),激光照射波长为656.5 nm,光照射功率为40 mW/cm2,研究了肿瘤周围血管在激光照射下的血管管径变化和血流速度分布变化。研究表明,通过对血管管径和血流速度的监测,激光散斑衬比成像技术可以用于评估光动力治疗过程中的肿瘤周围血管损伤效应。

Fugene 6脂质体介导pEGFP-C1转染人源肺癌细胞(SPC-A1),经G418抗性筛选和96孔板有限稀释获得稳定高表达GFP的单克隆细胞株SPC-A1-EGFP.裸鼠腹腔注射SPC-A1-EGFP细胞建立自发转移模型;裸鼠尾静脉注射SPC-A1-EGFP细胞建立实验转移模型.利用整体光学成像系统(whole-body optical imaging system)对荷瘤鼠整体荧光成像.结果表明,整体光学成像系统可实时非侵入监测腹腔肿瘤生长和扩散过程,通过胸腔皮瓣窗(chest-wall skin-flap window)可低侵入检测肺转移.该研究为在体监测原位移植瘤的自发转移和发现抗肿瘤新药物提供了良好实验平台.