1 引言

近年来,与畜禽饲养中微量元素的添加及其作用相关的报道较多,尤其是对铜元素的研究更为深入。铜是血、肝、脑等铜蛋白的组成部分,也是几种酶的必需成分,可保护细胞免受氧代谢的影响,保护细胞结构及其功能的完整性^[1]。研究表明,高铜饲料能够促进仔猪的生长速度^[2],并可在一定程度上减少或避免其发生腹泻。在对猪饲料进行添加的过程中,不但要合理添加铜元素的剂量,还要考虑猪的营养需求和营养平衡,这样可以更好地发挥铜元素促进生长、提高饲料转化率并加强机体抗病能力的作用^[3]。但是由于经济利益的驱使,饲料厂商或养殖户会在饲料中添加过量的铜元素,导致饲料的成本升高。此外,有研究表明,当猪饲料中硫酸铜的质量分数达到2.50×10^-4时,会导致猪发生铜中毒现象,而且有95%以上的铜会随粪便排出体外,严重污染环境。畜禽饲喂铜超标的日粮后,其肝脏、肉等处的铜含量将远远超过食品卫生标准规定的含量,人类食用这些食品后,铜元素会在肝、肾、脑等组织中累积,危害健康^[4]。

检测猪饲料中重金属元素含量的传统光谱方法主要有电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)^[5]、电感耦合等离子体-质谱分析法(ICP-MS)^[6]、原子吸收光谱法(AAS)^[7]、分光光度法^[8]等。虽然这些化学方法具有检测限低、准确度高等优点,但样品预处理过程繁琐,需要采用化学试剂对样品进行消解处理,而且对操作人员的专业程度要求也较高,亦无法达到大批量、大范围的检测要求,检测过程引入的化学试剂易对样品造成污染。激光诱导击穿光谱(LIBS)定量分析检测技术是一种基于原子和离子的发射光谱分析技术,它利用高能脉冲激光聚焦到入射样品表面产生激光等离子体,然后再对等离子体中的原子和离子发射光谱进行定性和定量分析^[9-11]。该技术具有实时在线检测、样品制备比较简单、检测基体形态多样等优点,目前已广泛应用于食品检测^[12-13]、空间探测^[14]、工业控制^[15]和冶金分析^[16]等领域。

激光诱导击穿光谱能够反映被测物的基本特征信息,但原始激光诱导击穿光谱数据中包含有大量的数据点,其中有许多无用的、不相关的信息,这些信息会降低光谱模型的预测性能,因此建模时往往要通过去除噪音或干扰的方法来优选有效信息^[17]。基于模型集群分析的竞争自适应重加权采样(CARS)算法相较于其他波长变量筛选算法具有一定的优越性^[18]。目前,采用CARS算法结合激光诱导击穿光谱对样品中元素进行分析的研究报道较少。李江波等^[19]利用近红外高光谱技术结合竞争自适应重加权法-偏最小二乘(CARS-PLS)模型对鸭梨可溶性固形物的含量进行了定量预测,CARS算法不仅可以去除原始光谱数据中的无信息变量,而且能够对共线性的变量进行压缩去除,能够有效地对高光谱数据变量进行选择;刘燕德等^[20]基于CARS算法对脐橙可溶性固形物进行了近红外在线检测,光谱经过预处理后,分别应用向后区间偏最小二乘法(BiPLS)、遗传算法(GA)和CARS算法筛选特征变量,结果发现采用CARS算法筛选的特征变量建立的偏最小二乘(PLS)模型的预测结果最优。基于此,本研究拟采用共线双脉冲激光诱导击穿光谱(DP-LIBS)结合CARS算法优选猪饲料样品激光诱导击穿光谱的特征波长变量,以提高模型的稳定性和预测的准确性,进一步丰富激光诱导击穿光谱在猪饲料定量分析领域的应用。

2 材料与方法

2.1 样品制备

试验所用饲料均是按照生长肥育猪饲料配方配制而成的,饲料原料用粉碎机粉碎后按比例配重称量后再均匀混合。用精密电子天平称取一定量的纯无水硫酸铜(纯度不低于99.0%),将其与50 mL超纯水配制19组浓度不同的硫酸铜溶液;然后将自制饲料与硫酸铜溶液置于120 mm培养皿中搅拌均匀,静置30 min后将19组培养皿样品放入冷冻干燥机(SCIENTZ-50F型)中,干燥后制成干燥饲料。采用湿法消解法^[21]中的化学前处理对每组干燥后的饲料粉末样品进行处理,再采用原子吸收光谱(AAS)法对消解液进行检测,得到各饲料样品中Cu元素的真实含量,如表1所示。然后在每组浓度的饲料中分别称取3份质量为4 g的干燥饲料,再用手动压片机将其压制成直径为30 mm的圆饼状,每组浓度各压制3个样品,共57个样品。

2.2 试验装置及光谱检测

试验所用激光诱导击穿光谱系统示意图如图1所示。整个试验光路过程为固体Nd∶YAG激光器(Vlite200型,输出波长为1064 nm)发射脉冲激光,激光通过45°反射镜改变方向,激光经由焦距为100 mm的平凸透镜聚焦到样品表面产生等离子体,发射出来的等离子体经平凸透镜形成平行光,再经带孔反射镜使光路水平入射到平凸透镜上,之后聚焦到光纤探头上,双通道光谱仪通过光纤收集光谱信号,光谱信号最终显示在计算机上,以DG645数字延迟发生器作为激光器与光谱仪的精确外触发信号装置。为了防止样品被局部灼伤,将样品放在SC300二维旋转平台上,旋转平台带动样品转动。采集激光诱导击穿光谱时,每个样品分别选择3个位置进行激光检测,每个位置上采集100个点。为了获得更好的检测效果,试验前对激光脉冲延迟、采集延迟、激光能量等关键参数进行优化,优化后的最佳试验条件为:激光脉冲延迟450 ns,激光采集延迟时间1.28 μs,激光A的能量157.77 mJ,激光B的能量196.87 mJ。

图 1. 激光诱导击穿光谱系统示意图

Fig. 1. Schematic of LIBS system

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图2为铜元素质量分数为4.2459×10^-4的猪饲料样品在322~329 nm波长范围内的激光诱导击穿光谱谱线信息。可以看出:明显的Cu元素的特征谱线为324.74 nm和327.38 nm,且Cu I 324.74 nm波长处的相对发射强度较大,将其作为Cu元素的特征分析谱线。

图 2. 铜质量分数为4.2459×10-4的猪饲料样品在322~329 nm波段内的激光诱导击穿光谱图

Fig. 2. LIBS spectrum of pig feed samples with copper mass fraction of 4.2459×10-4 in 322-329 nm band

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2.3 数据处理与分析

CARS算法是近年来提出的一种变量选择方法。该算法是依据达尔文进化理论中“适者生存,不适者淘汰”的原则提出的。该算法将每一个波长视为一个独立的个体,对不适应的个体进行剔除,选择保留适应的关键个体。在选择变量的过程中,通过自适应重加权采样技术对PLS建模中回归系数绝对值较大的波长变量进行筛选,与此同时去除回归系数绝对值小的波长变量,进行数次重复筛选后,可以获得包含多个波长变量的子集^[22-23]。

采用CARS变量选择方法对猪饲料光谱的波长变量进行筛选,选择与猪饲料中铜元素相关的特征波长变量。CARS算法提取的最优变量数由蒙特卡罗交叉验证方法选择,CARS算法参数的最大主成分数为8,蒙特卡罗运算的样本数为50,交互验证的样本数为5,运算次数为50,利用PLS交叉验证建模,获得交叉验证均方根误差(RMSECV)最小的优选变量子集。CARS变量选择方法通过MATLAB R2014a软件完成^[24]。

2.4 PLS建模

采用CARS算法筛选出与猪饲料中铜元素相关的重要波长变量后,对筛选出的重要波长变量采用PLS方法建立猪饲料中铜元素的预测模型,最后对预测集猪饲料样品中的铜元素含量进行预测,并将其与采用全光谱建立的PLS模型的预测结果进行对比。

3 结果与讨论

3.1 CARS变量优选

采用CARS算法对猪饲料样品的激光诱导击穿光谱进行变量优选,结果如图3所示。原光谱数据波段范围为206.29~331.41 nm,有2048个波长变量,比较每个采样次数的RMSECV值,直至找到RMSECV最小值所包含的最优变量子集。图3(a)为波长变量筛选过程中被选中的波长数量的变化趋势。剔除波长变量的速度随着运行次数的增长而减缓,当运行次数较少时,淘汰变量的速度非常快,当运行次数为5时,保留下来的波长变量只有原来的20%,表现出了CARS算法粗选变量的过程;当运行次数大于5后,波长变量在每次运行中被剔除的速度愈来愈慢,数量愈来愈少,体现了CARS算法对变量精选的过程。图3(b)为波长变量筛选过程中RMSECV的变化趋势,在前33次的运行中,RMSECV随运行次数的增加而逐渐减小,在运行33次后逐渐增大,虽然运行35次后RMSECV值略有变小的趋势,但是在运行第33次时的RMSECV值最小。由此可知,在运行第33次时,基本上已经将与饲料中铜元素含量没有关系的波长变量剔除了,之后的运行过程有可能是在淘汰比较重要的相关波长变量,因此导致RMSECV值增大。图3(c)为波长变量筛选过程中各波长变量回归系数的变化趋势,“*”对应的RMSECV值最小,即第33次采样。根据RMSECV最小的选择原则,确定重要的波长变量个数为22个。

图 3. 猪饲料的CARS变量优选图。(a)波长数量的变化趋势图;(b) RMSECV的变化趋势图;(c)波长变量回归系数的变化趋势图

Fig. 3. CARS variable preference diagrams of pig feed. (a) Trend chart of wavelength number; (b) trend chart of RMSECV; (c) trend chart of wavelength variable regression coefficient

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3.2 PLS建模及模型验证

图4为全光谱-PLS模型的预测结果。由图4可知:建模集样品中Cu元素含量的预测值与真实值之间的相关系数R²为0.9676,预测集样品中Cu元素含量的预测值与真实值之间的相关系数R²为0.9533。

为了实现定量检测饲料中Cu元素的含量,采用CARS-PLS建立模型,并对试验结果进行定量分析。图5(a)为建模集样品中Cu元素含量的真实值和预测值之间的相关曲线,图5(b)为模型对预测集样品中铜元素含量的预测。由图5可知:该模型的预测结果较好,建模集样品中Cu元素含量预测值与真实值之间的相关系数R²为0.978;预测集样品中Cu元素含量的预测值与真实值之间的相关系数R²为0.9932。

将CARS算法选择的波长变量采用PLS交叉验证建模,并与全光谱PLS交叉验证结果进行比较。由表2可知,CARS变量选择方法的RMSECV值较小,波长变量个数减少为22个。

图 4. 全光谱-PLS模型预测结果。(a)建模集;(b)预测集

Fig. 4. Predicted results of all optical spectrum-PLS model. (a) Modeling set; (b) prediction set

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图 5. CARS-PLS模型预测结果。(a)建模集;(b)预测集

Fig. 5. Predicted results of CARS-PLS model. (a) Modeling set; (b) prediction set

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表3列出了预测集11个饲料样品中Cu元素的真实含量、模型预测含量和平均相对误差,其中平均相对误差表示预测值偏离真实值的大小。11个预测集样品中Cu元素含量的平均相对误差为5.59%。

采用CARS算法筛选出了与猪饲料中铜元素相关的22个重要波长变量,它们分别为209.73,211.51,218.88,219.15,224.61,247.38,256.49,260.49,260.87,261.244,263.13,270.30,272.15,282.98,286.45,298.14,303.13,312.02,324.74,327.28,327.38,330.11 nm。结合激光诱导击穿光谱和美国国家原子光谱标准与技术(NIST)数据库可知,上述变量包含了Cu的特征谱线(324.74 nm和327.38 nm),另外还有一些常见的微量元素。如:218.88 nm和224.61 nm是铁的谱线,211.51 nm是钠的谱线,256.49 nm是镁的谱线。可以看出,CARS主要优选出的是与Cu元素相关的特征波长以及同种类金属元素Na、Fe和Mg的特征波长,说明了CARS变量筛选方法的有效性。与波长变量建模相比,CARS-PLS模型能够有效去除无相关性波长变量对模型的干扰,提高了模型的相关系数,模型变量数是全波长变量的1.1%,变量数大幅降低,预测值和真实值之间具有较好的吻合性,降低了样品预测的平均相对误差,建立的模型质量较好,具有较高的预测精度。

4 结论

将激光诱导击穿光谱结合CARS变量选择方法应用于猪饲料中铜元素含量的预测,结果表明,采用CARS算法获得的关键变量所建立的PLS模型质量较高,模型参数R²、RMSECV、平均相对误差分别达到了0.978、19.25、5.59%。试验结果表明,CARS变量选择方法可以较好地优化预测模型和提高模型预测的准确度。基于LIBS光谱数据用CARS-PLS方法建模,模型的定量分析结果与标准值的相对误差较小,获得了满意的预测精度。