水体细菌微生物多波长透射光谱解析模型

胡玉霞; 赵南京; 甘婷婷; 段静波; 喻慧娟; 孟德硕; 刘建国; 刘文清

doi:doi:10.3788/AOS201737.0830001

光学学报, 2017, 37 (8): 0830001, 网络出版: 2018-09-07

水体细菌微生物多波长透射光谱解析模型下载： 856次

An Analytical Model for Multi-Wavelength Transmittance Spectra of Bacteria in Water

论文大纲

胡玉霞 ^1,2,3赵南京 ^1,3,*甘婷婷 ^1,3段静波 ^1,3喻慧娟 ^1,2,3孟德硕 ^1,3刘建国 ^1,3刘文清 ^1,3

作者单位

¹ 中国科学院安徽光学精密机械研究所环境光学与技术重点实验室, 安徽合肥 230031

² 中国科学技术大学, 安徽合肥 230026

³ 安徽省环境光学监测技术重点实验室, 安徽合肥 230031

光谱学多波长透射光谱 Mie散射细菌微生物解析模型 spectroscopy multi-wavelength transmission spectrum Mie scattering bacterial microorganism analytical model

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摘要

细菌多波长透射光谱包含有细菌结构、组分、浓度等信息,这些特征信息的有效提取是实现细菌微生物快速识别与检测的基础。以水体常见的大肠埃希氏菌(大肠杆菌)为研究对象,采用紫外-可见分光光度法获得了其多波长透射光谱;基于Mie散射理论,在充分考虑水体大肠杆菌散射和吸收特性的基础上,构建了240~900 nm波段范围内细菌微生物多波长透射光谱的解析模型;基于该模型对250~750 nm特征波段范围内的光谱进行解析,获得了大肠杆菌的体积、粒径、结构及浓度等相关参数,并将这些参数与文献及实验得到的结果进行了对比验证。结果表明,建立的多波长透射光谱解析模型能够准确表征水体细菌微生物的光谱特征,该模型可为水体细菌微生物的快速识别分析和检测提供关键数据。

Abstract

Multi-wavelength transmittance spectra of bacteria in water contain lots of information on their characteristics such as structure, constituent and concentration, and the effective extraction of the information is the foundation of rapid identification and detection of bacteria. The transmittance spectrum of Escherichia coli is recorded with a ultraviolet-visible spectrophotometer. According to Mie scattering theory and absorption and scattering properties, bacterial multi-wavelength transmittance spectrum analytical model in 240-900 nm band is constructed. Based on the model, the spectrum in the range of 250-750 nm is analyzed, the related parameters such as volume, diameter, structure and concentration of Escherichia coli cells are obtained, and these parameters are then compared with the literature data or experimental data. It is shown that the proposed multi-wavelength transmission spectrum model can accurately characterize the spectral features of bacteria in water, and the model can provide important parameters for the rapid analysis and detection of bacteria in water.

1 引言

水体细菌微生物污染严重威胁着人类的身体健康和生态环境安全。发展快速、有效、低成本的细菌微生物检测方法是保障饮用水安全的关键。

目前,检测水体细菌微生物的方法主要有显色培养基法^[1]、核酸探针技术法^[2]和蛋白芯片法^[3]等。虽然这些方法的检测结果相对准确,但是检测过程复杂,耗时长,所需生物学试剂比较昂贵,不适合实时在线检测。为了实现水体细菌微生物的快速识别与检测,近年来国内外相关学者采用荧光光谱法^[4-6]、拉曼光谱法^[7-9]以及角散射光谱法^[10]等光学检测方法,针对细菌微生物的部分结构或组分特征信息等进行了研究。与之相比,多波长透射光谱测量技术具有仪器设备相对简单、测量速度快、可测量粒径范围较宽、测量信息全面,以及能够实时在线测量等优点,一些学者已经将该技术应用于细菌微生物领域的研究中。Katz等^[11]测量得到了3种大小和形态不同的细菌的消光光谱和角散射光谱,并利用高斯散射理论对透射光谱进行反常衍射分析,得到了细菌体的平均直径。Mourant等^[12]利用Rayleigh-Debye-Gans近似和奇异衍射理论分析了细胞的形状和内在结构。虽然现有的研究能够通过透射光谱得到细菌的特征参数,但这些研究考虑的因素较为单一,或者仅是从理论出发,脱离了被测物质本身的结构特征,存在诸多问题,如:1) 多角度散射光谱对仪器的要求较高;2) 针对理想的瑞利散射和奇异衍射条件建模,难以与实际水体细菌微生物的状况相关联;3) 无法体现细菌中核酸、蛋白质等主要组分对透射光谱的影响。

基于此,本文采用紫外-可见分光光度计对大肠杆菌的多波长透射光谱进行了测定,并分析了光谱的特征。根据细菌散射部分的折射率以及Murell^[13]给出的细菌微生物的主要化学组分(核酸、氨基酸等)在不同波长下的吸收系数,同时基于Mie散射理论,构建了水体细菌微生物多波长透射光谱的解析模型,并分析了该模型的准确性。

2 制备样品与获取光谱

大肠埃希氏菌菌种购于中国工业菌种保藏管理中心,菌种悬浮液的制备流程为:菌种活化→接种到牛肉膏蛋白胨培养基中培养→液体培养基扩菌培养→离心机离心→去离子水清洗。

采用岛津UV2550型紫外-可见分光光度计测量多波长透射光谱,光谱测量范围为240~900 nm,采样间隔为1 nm,以去离子水作为参比。重复测量3次,取平均值作为测量结果。

采用平板培养法测细菌的浓度。取10 mL细菌悬浮液,加入去离子水稀释至100 mL,摇匀即成10^-1稀释菌液;按照10倍稀释,分别制成10^-2,10^-3,…,10^-9等一系列稀释菌液。用1 mL的无菌吸管吸取不同浓度的稀释菌液放入平皿中,然后在平皿中分别倒入45 ℃的营养琼脂培养基,轻轻转动平皿,使菌液与培养基混合均匀;将平皿冷凝倒置,置于37 ℃的培养箱中培养24 h,进而统计菌落数。

图1为处于生长稳定期的大肠杆菌的多波长透射光谱,纵轴表示光密度值,其计算公式为

\begin{matrix} τ = \lg \frac{1}{T} = \lg \frac{1}{I_{trs} / I_{i}} = \lg \frac{I_{i}}{I_{trs}}, (1) \end{matrix}

式中I_i和I_trs分别为入射光强和透射光强;τ为光密度,包含大肠杆菌的散射和吸收信息。根据细胞的组成、特性以及细胞中核酸、蛋白质及其它生物大分子的紫外光谱的分布特征^[14]可知:在240~400 nm范围内,大肠杆菌在260 nm处存在一个肩峰,这主要是由细菌内核酸分子对光的吸收作用造成的;在400~900 nm范围内,透射光谱的变化比较平缓,没有明显的吸收峰,这主要源于细菌的散射作用。这些特征为多波长透射光谱解析模型的构建以及复折射率的计算提供了依据。

图 1. 大肠杆菌的多波长透射光谱

Fig. 1. Multi-wavelength transmission spectrum of Escherichia coli

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3 多波长透射光谱的解析模型

3.1 模型的构建

当光波穿过含有细菌的水体介质后,透射光强会发生衰减,衰减的程度由吸收和散射共同决定,而细菌的散射和吸收特性则取决于其结构形态和化学组分^[15]。根据Mie散射理论,对于粒径分布为f(D)的均匀的细菌悬浮液,光密度的表达式为^[16]

\begin{matrix} τ (λ) = N_{p} l \frac{π}{4} \overset{\infty}{\int_{0}} Q_{ext} [m (λ), D] D^{2} f (D) dD, (2) \end{matrix}

式中m(λ)为细菌在悬浮液中的复折射率,λ为波长;D为细菌的直径;l为光程;N_p为细菌数;Q_ext[m(λ),D]为细菌的消光系数,由吸收系数Q_abs和散射系数Q_sca两部分组成。对于近似球形的粒子,其消光系数和散射系数计算公式为^[17]

\begin{matrix} \begin{matrix} Q_{ext} = \frac{2}{α^{2}} Re [\overset{\infty}{\sum_{n = 1}} (2 n + 1) (a_{n} + b_{n})], (3) \\ Q_{sca} = \frac{2}{α^{2}} \overset{\infty}{\sum_{n = 1}} (2 n + 1) ({|a_{n}|}^{2} + {|b_{n}|}^{2}), (4) \\ a_{n} = \frac{ψ'_{n} (mα) ψ_{n} (α) - m ψ_{n} (mα) ψ'_{n} (α)}{ψ'_{n} (mα) ξ_{n} (α) - m ψ_{n} (mα) ξ'_{n} (α)}, (5) \\ b_{n} = \frac{mψ'_{n} (mα) ψ_{n} (α) - ψ_{n} (mα) ψ'_{n} (α)}{mψ'_{n} (mα) ξ_{n} (α) - ψ_{n} (mα) ξ'_{n} (α)}, (6) \end{matrix} \end{matrix}

式中a_n、b_n为Mie系数;n为级数需要计算的最大项; α=πD/λ;ψ_n(x)= $\begin{matrix} \sqrt[]{πx / 2} \end{matrix} \begin{matrix} J_{n + \frac{1}{2}} \end{matrix}$ (x), $\begin{matrix} J_{n + \frac{1}{2}} \end{matrix}$ (x)为半整数阶Bessel函数;ξ_n(x)= $\begin{matrix} \sqrt[]{πx / 2} \end{matrix} \begin{matrix} H_{n + \frac{1}{2}}^{2} \end{matrix}$ (x), $\begin{matrix} H_{n + \frac{1}{2}} \end{matrix}$ (x)为第二类Hankel函数。

m(λ)的计算公式为

\begin{matrix} m (λ) = \frac{n (λ) + ik (λ)}{n_{0} (λ)}, (7) \end{matrix}

式中n(λ)为细菌复折射率的实部,k(λ)为细菌复折射率的虚部,n₀(λ)为细菌悬浮液的折射率^[18]。

在240~900 nm波段范围内,为了更好地刻画细菌的结构特征,在建模时将大肠杆菌的细胞分为两部分,一部分为细菌的宏观结构及其尺寸,另一部分为细菌的内部结构。光谱受细菌宏观结构粒径分布和内部结构粒径分布变化的影响很小^[19-20],因此,细菌的粒径分布函数f₁(D)和f₂(D)可近似用宏观结构的平均直径D₁和内部结构的平均直径D₂表示。根据(2)式,在240~900 nm波段范围内细菌的光密度计算公式可改写为

\begin{matrix} τ (λ_{0}) = N_{p} l \frac{π}{4} \{z Q_{ext 1} [m_{outer} (λ_{0}), D_{1}] D_{1}^{2} + (1 - z) Q_{ext 2} [m_{inner} (λ_{0}), D_{2}] D_{2}^{2}}, (8) \end{matrix}

式中m_outer(λ₀)和m_inner(λ₀)分别为细菌外部结构的折射率和内部结构的折射率,z为细菌外部结构占总消光的比例。(8)式为水体细菌多波长透射光谱模型的通用形式,等号右侧第一项为细菌外部结构的消光特性,第二项为内部结构的消光特性。吸收部分复折射率的实部和虚部是化学组分的函数,每部分化学组分折射率的加权和为

\begin{matrix} \begin{matrix} n_{g} = \overset{M}{\sum_{j = 1}} w_{gj} n_{gj}, (9) \\ k_{g} = \overset{M}{\sum_{j = 1}} w_{gj} k_{gj}, (10) \end{matrix} \end{matrix}

式中w_gj为第g部分第j个组分的质量分数,M为化学组分的总数,n_g和k_g分别为第g部分各组分折射率的实部和虚部。m_g(λ)作为化学组分的函数,可通过M个化学组分的加权和进行计算:

\begin{matrix} m_{g} (λ) = \frac{\overset{M}{\sum_{j = 1}} w_{gj} n_{gj}}{n_{0} (λ)} + \frac{i \overset{M}{\sum_{j = 1}} w_{gj} k_{gj}}{n_{0} (λ)} 。 (11) \end{matrix}

为了描述细菌的透射光谱,需要对细菌的复折射率m_outer(λ₀)和m_inner(λ₀)进行计算。

3.2 散射部分折射率的计算

细菌的散射分为外部结构散射和内部结构散射,在240~900 nm范围内,不考虑吸收物质的作用,细菌复折射率的实部可以通过柯西公式来估算:

\begin{matrix} n (λ) = a_{0} + \frac{a_{1}}{λ^{2}} + \frac{a_{3}}{λ^{4}} + \dots, (12) \end{matrix}

式中a₀、a₁和a₃为常数,由介质决定。

根据文献[ 21]可知,大肠杆菌宏观结构复折射率的实部为

\begin{matrix} n (λ_{0}) = 1.3776 + \frac{3034.91}{λ_{0}^{2}} 。 (13) \end{matrix}

根据文献[ 12]可知,大肠杆菌细胞的内部结构比外部结构多了一些非吸收蛋白质和多糖分子,细菌平均复折射率的实部为

\begin{matrix} n (λ_{0}) = 1.550 + \frac{5900}{λ_{0}^{2}} 。 (14) \end{matrix}

3.3 吸收部分折射率的计算

细菌对光的吸收能力主要取决于细菌内化学组分(核酸、氨基酸、吡啶二羧酸等)的吸收作用^[15]。因此,细菌对光的吸收可近似为细菌主要化学组分对光的吸收的总和。大肠杆菌中不含有吡啶二羧酸(DPA),吸收部分的折射率可近似为细菌内发色团氨基酸和总核酸折射率的线性加和。

细菌微生物中主要组分的吸收系数与波长的关系如图2所示。在生物体中,组成蛋白质的氨基酸大约有20种,这些氨基酸在可见光区域没有吸收,在远紫外区有吸收。在紫外区(240~300 nm),含有苯环共轭双键系统的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸对光具有吸收能力,最大吸收波长为280 nm。核酸中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双键系统,对250~280 nm波长的紫外光具有强烈的吸收作用。发色团氨基酸和核酸在可见波段近似为无吸收,由此可以确定核酸和发色团氨基酸在240~900 nm波段的吸收系数。

图 2. 细菌微生物中总核酸、发色团氨基酸和吡啶二羧酸的吸收系数[13]

Fig. 2. Absorption coefficients of total nucleic acid, chromophoric amino acid, and dipicolinic acid in bacterial microorganism[13]

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根据Beer-Lambert定律,发色团氨基酸、总核酸的吸收系数ε(λ)与复折射率虚部k(λ)的关系可表示为

\begin{matrix} ε (λ) = \frac{4 πk (λ)}{λ} 。 (15) \end{matrix}

得到发色团氨基酸和总核酸的吸收系数后,将其代入(15)式就可计算出发色团氨基酸和总核酸复折射率的虚部,如图3所示。

图 3. (a)发色团氨基酸和(b)总核酸复折射率的虚部

Fig. 3. Imaginary part of complex refractive index of (a) chromophoric amino acid and (b) total nucleic acid

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根据发色团氨基酸和总核酸复折射率的虚部,基于Kramers-Kronig关系(K-K关系)^[22-23]就可计算出复折射率的实部。K-K关系可表示为

\begin{matrix} \begin{matrix} k_{1} (λ) = \frac{- 2}{π} P \overset{\infty}{\int_{0}} \frac{λ n_{1} (λ_{0})}{λ^{2} - λ_{0}^{2}} d λ_{0}, (16) \\ n_{1} (λ) - 1 = \frac{2 λ^{2}}{π} P \overset{\infty}{\int_{0}} \frac{k_{1} (λ_{0})}{λ_{0} (λ^{2} - λ_{0}^{2})} d λ_{0}, (17) \end{matrix} \end{matrix}

式中k₁(λ)为复折射率的虚部,n₁(λ)为复折射率的实部,λ为波长,P为柯西主值函数。实际上,考虑到仪器的工作稳定性以及电磁波的有效利用范围,若已知发色团氨基酸和核酸在240~900 nm波段范围的复折射率的虚部,则其它波段复折射率的虚部就可通过常数外推得到^[24]。根据(17)式可计算出细菌内发色团氨基酸和总核酸复折射率实部的变化量,即n₁(λ)-1,计算结果如图4所示。

图 4. (a)发色团氨基酸和(b)总核酸复折射率实部的变化量

Fig. 4. Variation in real part of complex refractive index of (a) chromophoric amino acid and (b) total nucleic acid

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由于细菌细胞的内部结构和化学组分较为复杂,将细菌对光的吸收近似为细菌内主要化学组分对光吸收的加和,可使问题得到简化。

4 结果与讨论

为了消除细菌浓度对光密度的影响,对测量的透射光谱进行总和归一化处理,转换公式为

\begin{matrix} τ (λ_{0}) = τ_{λ_{0}} /_{} \overset{λ = 900}{\sum_{λ = 240}} τ_{λ} (18) \end{matrix}

根据(8)式建立的模型,利用非线性最小二乘算法对归一化后的240~900 nm波段的透射光谱进行迭代拟合,测量光谱与拟合光谱的残差平方和为2.9209×10^-7。测量光谱与拟合光谱的对比结果如图5所示,可以看出,测量光谱与拟合光谱间的残差较小,说明建立的光谱解析模型能够有效地表征大肠杆菌的光谱特征。

图 5. 大肠杆菌测量光谱与模拟光谱的比较

Fig. 5. Comparision between measured and calculated optical density spectra of Escherichia coli

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表1给出了不同波段下实测光谱与模拟光谱之间的相对误差。在250~400 nm波段内,总核酸的吸收带位于260 nm处,蛋白质的吸收带位于280 nm处,该波段包含了细菌较多的吸收特征信息,平均相对误差小于1%。400~750 nm的可见光波段主要包含了细菌散射作用的信息,平均相对误差仅为0.97%。在240~250 nm和750~900 nm波段,平均相对误差较大,均高于250~750 nm波段内的平均误差,且该波段范围所包含的细菌光谱的主要特征信息较少。

表 1. 不同波段下测量光谱与模拟光谱的相对误差

Table 1. Relative error between measured and calculated optical density spectra in different bands

Wavelength /nm	240-250	250-400	400-750	750-900	240-900
Maximum relative error /%	6.18	3.11	3.12	9.76	9.76
Average relative error /%	2.09	0.99	0.97	3.67	1.62

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为了验证模型的准确性并使解析参数更加准确,对250~750 nm波段的透射光谱进行了重点研究,表2给出了基于模型得到的相关的解析参数。

表 2. 250~750 nm波段范围内大肠杆菌透射光谱模型解析参数

Table 2. Calculated parameters from the transmittance model in 250-750 nm band for Escherichia coli

Parameter	Calculated value	Literature/experimental value
Volume /μm³	4.6093	1-7^[23]
Average diameter of external structure $\begin{matrix} {D_{1}}_{} \end{matrix}$ /μm	2.0648	1.9189
Particle number $\begin{matrix} {N_{p}}_{} \end{matrix}$ /mL^-1	20497000	20000000
Average diameter of internal structure $\begin{matrix} {D_{2}}_{} \end{matrix}$ /μm	0.0667
Volume fraction of internal structure /%	30

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由表2给出的平均粒径可计算出大肠杆菌的体积为4.6093 μm³,其值与文献[ 25]报道的大肠杆菌的体积相吻合。采用光学显微镜测量得到的大肠杆菌的平均粒径为1.9189 μm,与模型计算值2.0648 μm的相对误差为7.07%。将模型的解析参数代入(7)式可得到单个大肠杆菌的光谱,将测量光谱与单个大肠杆菌的模拟光谱进行对比,根据光程l=1 cm可计算出细菌的浓度。为了提高计算的准确性,对测量光谱与单个大肠杆菌的模拟光谱进行线性回归,结果如图6所示。

图 6. 单个大肠杆菌模拟光谱与测量光谱的线性拟合关系

Fig. 6. Correlation between calculated spectra and measured spectra of single Escherichia coli cell

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在图6中,黑色点表示每个波长的计算光谱与实测光谱的对应关系,红色线表示这些点的线性拟合,模拟光谱与测量光谱拟合的相关系数达到了0.9998,计算得到细菌浓度为2.0497×10⁷ mL^-1,而平板计数法测得的细菌浓度为2.0000×10⁷ mL^-1,它们的相对误差为2.49%。可见,通过所建模型获得的细菌相关参数可以作为水体细菌微生物快速识别与检测的基础数据。

5 结论

以Mie散射理论为基础,结合细菌生理学结构分析了水体细菌(大肠杆菌)的散射和吸收特性,构建了细菌多波长透射光谱的解析模型。所建模型不仅包含细菌散射特性的信息,而且还包含了吸收特性的信息,这是该模型的优势。使用该模型对大肠杆菌的光谱进行模拟,模拟光谱与实测光谱的残差值较低,说明模型能够准确地表征水体细菌的光谱特征。利用该模型对250~750 nm波段范围内的大肠杆菌的透射光谱进行解析,得到大肠杆菌的体积为4.6093 μm³,与文献报道的结果相吻合。计算得到的细菌浓度与平板计数法测得的细菌浓度的相对误差为2.49%,这表明构建的解析模型能够准确获得细菌的特征信息。构建的水体细菌微生物多波长透射光谱解析模型不仅可为细菌微生物科学研究提供新的测量手段,而且可以为水体细菌微生物的快速识别与检测提供基础参数。

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1 引言

2 制备样品与获取光谱

图 1. 大肠杆菌的多波长透射光谱

Fig. 1. Multi-wavelength transmission spectrum of Escherichia coli

3 多波长透射光谱的解析模型

3.1 模型的构建

3.2 散射部分折射率的计算

3.3 吸收部分折射率的计算

图 2. 细菌微生物中总核酸、发色团氨基酸和吡啶二羧酸的吸收系数[13]

Fig. 2. Absorption coefficients of total nucleic acid, chromophoric amino acid, and dipicolinic acid in bacterial microorganism[13]

图 3. (a)发色团氨基酸和(b)总核酸复折射率的虚部

Fig. 3. Imaginary part of complex refractive index of (a) chromophoric amino acid and (b) total nucleic acid

图 4. (a)发色团氨基酸和(b)总核酸复折射率实部的变化量

Fig. 4. Variation in real part of complex refractive index of (a) chromophoric amino acid and (b) total nucleic acid

4 结果与讨论

图 5. 大肠杆菌测量光谱与模拟光谱的比较

Fig. 5. Comparision between measured and calculated optical density spectra of Escherichia coli

表 1. 不同波段下测量光谱与模拟光谱的相对误差

Table 1. Relative error between measured and calculated optical density spectra in different bands

表 2. 250~750 nm波段范围内大肠杆菌透射光谱模型解析参数

Table 2. Calculated parameters from the transmittance model in 250-750 nm band for Escherichia coli

图 6. 单个大肠杆菌模拟光谱与测量光谱的线性拟合关系

Fig. 6. Correlation between calculated spectra and measured spectra of single Escherichia coli cell

5 结论

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1 引言

2 制备样品与获取光谱

图 1. 大肠杆菌的多波长透射光谱

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3 多波长透射光谱的解析模型

3.1 模型的构建

3.2 散射部分折射率的计算

3.3 吸收部分折射率的计算

图 2. 细菌微生物中总核酸、发色团氨基酸和吡啶二羧酸的吸收系数[13]

Fig. 2. Absorption coefficients of total nucleic acid, chromophoric amino acid, and dipicolinic acid in bacterial microorganism[13]

图 3. (a)发色团氨基酸和(b)总核酸复折射率的虚部

Fig. 3. Imaginary part of complex refractive index of (a) chromophoric amino acid and (b) total nucleic acid

图 4. (a)发色团氨基酸和(b)总核酸复折射率实部的变化量

Fig. 4. Variation in real part of complex refractive index of (a) chromophoric amino acid and (b) total nucleic acid

4 结果与讨论

图 5. 大肠杆菌测量光谱与模拟光谱的比较

Fig. 5. Comparision between measured and calculated optical density spectra of Escherichia coli

表 1. 不同波段下测量光谱与模拟光谱的相对误差

Table 1. Relative error between measured and calculated optical density spectra in different bands

表 2. 250~750 nm波段范围内大肠杆菌透射光谱模型解析参数

Table 2. Calculated parameters from the transmittance model in 250-750 nm band for Escherichia coli

图 6. 单个大肠杆菌模拟光谱与测量光谱的线性拟合关系

Fig. 6. Correlation between calculated spectra and measured spectra of single Escherichia coli cell

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