1 引言

随着光学显微镜技术,荧光蛋白和纳米晶体等光谱技术的发展,实时成像技术已经进展到细胞及分子水平^[1]。通过这类技术追踪微米尺度微球获取信息的方法可应用于生物物理学,例如光镊测量和磁镊测量^[2-3]。在细胞外微环境中,微球跟踪测量在生命科学中扮演了一个极其重要的角色^[4],可用于血液细胞元素间及血管内皮细胞间的相互作用等方面^[1]。

近年来,微球位置的跟踪测量方法受到了国内外研究人员的广泛关注^[5]。目前对于微球横向位置的跟踪测量,主要方法有Hough变换法(HTM)^[6]、质心法^[7]、互相关法^[8]、梯度法^[9]等。这些方法都是根据微球图像的特征来测量的,然而实际测量中由于微球间以及微球与溶液中其他物质的相互作用力,微球与其他物体的交叠现象难以避免^[10],导致直接使用传统方法不能识别圆的特征而无法测量其横向位置,不利于实际应用。

雷海等^[11]对数字全息法重构强度图进行去卷积运算来消除散斑、离焦等信号的噪声。针对上述问题,本文基于这种方法提出全息重构聚焦法(HRFM),将其与Hough变换法相结合来实现对微球三维位置的测量,即对经同轴数字全息法重构后的聚焦微球强度图像采用Hough变换法测量微球的横向位置,再对横向位置所对应的强度曲线拟合得到其轴向位置。为验证本方法的可行性,首先对单个微球进行了测量,并与传统方法进行对比,结果表明采用本方法得到的测量结果明显优于传统方法。对微球与其他物体的交叠,以两个微球之间的交叠为例进行了测量,结果表明采用本方法可以实现对交叠微球的高分辨力三维位置测量,为其在分子动力学和生命科学领域拓宽了应用范围。

2 测量原理

同轴数字全息法的原理为,激光器发出平行光照射微球样品,经微球衍射的光作为衍射光,直接透过的光作为透射光。衍射光和透射光在物镜焦平面处发生干涉形成全息图,经物镜放大后被电荷耦合器件(CCD)相机接收。令衍射光和透射光分别为E_d(r,z),E_t(r,z),其中r为全息面坐标,z为微球到物镜焦平面的距离,则记录的全息图的强度可以表示为

Ih(r,0)=Ed(r,0)+Et(r,0)2。(1)

衍射光在传播时会逐渐变弱,到达焦平面时会有 Ed(r,0)2≪ Et(r,0)2,因此对全息图进行减背景和归一化处理可以得到

In(r,0)=Ih(r,0)Ib(r,0)-1≈2ReEd(r,0)·Et(r,0)/Ib(r,0)=2Reu(r,0),(2)

式中I_b(r,0)= Et(r,0)2为视场中无微球时记录图像的强度,u(r,0)为经微球衍射的光场,根据瑞利-索末菲衍射公式有

u(r,z)=u(r,0)⊗h(r,-z),(3)

式中h(r,-z)为瑞利-索末菲传递函数,可以表示为

h(r,-z)=12π∂∂zexp(ikR)R,(4)

式中R=r2+z2,k=2πn/λ为在折射率为n的介质中的波数。根据傅里叶变换的卷积特性经过计算可得

u(r,z)=FFT-1{FFT[In(r,0)]·H(q,-z)},(5)

式中F_FT表示傅里叶变换, FFT-1表示傅里叶逆变换,H(q,-z)=exp iz(k2-q2)12为h(r,-z)的傅里叶变换,通过(5)式可以得到微球三维重构光场强度分布I_d(r,z)=u(r,z)2,对光强分布进行去卷积运算^[12-13],再进行一定的分析处理即可得到微球的三维位置。提出的全息重构聚焦法结合了这种方法与Hough变换法,具体的处理过程主要有5个步骤,分别为:

1) 对系统采集的全息图进行减背景和归一化处理并进行重构的衍射计算;

2) 对重构所得强度图进行去卷积运算,消除散斑、离焦等噪声;

3) 根据所得的强度图得到其最大值分布曲线,找到微球聚焦位置;

4) 对微球聚焦位置的强度图采用Hough变换法,得到微球球心横向位置;

5) 对微球球心对应的强度曲线进行多项式拟合,得到微球轴向位置信息^[11]。

3 实验装置

实验装置如图1所示,由激光器发出平行光束,光束中经微球衍射的部分与未经微球衍射的部分在倒置的显微物镜焦面位置附近干涉,干涉图像经物镜放大后成像在CCD上。

图 1. 成像光路

Fig. 1. Optical imaging path

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系统中使用激光二极管光源(Edmund Optics,#39-569),波长为(670±10) nm。使用的显微物镜(Nikon, CFI L Plan EPI SLWD)放大倍率为100倍,数值孔径NA为0.70。CCD相机(Point Grey,GS2-GE-50S5M-C)的有效像素为2448 pixel×2048 pixel,像元尺寸为3.45 μm×3.45 μm,实验过程中一般使用非全区域成像25 frame·s^-1的采样速率。用于驱动样品移动的三维纳米位移台(nPoint, NPXY100Z25-102 & Controller C.300)X、Y、Z向行程分别为100,100,25 μm,定位噪声分别为0.3,0.3,0.1 nm。

4 实验结果与分析

4.1 单个微球实验

图 2. (a)单个微球的全息图;(b)归一化后的单个微球全息图;(c)单个微球重构后的聚焦图像

Fig. 2. (a) Hologram of single particle; (b) normalized hologram of single particle; (c) focused image after reconstruction of single particle

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为验证该算法的可行性,对5 μm直径聚苯乙烯微球样品进行纳米级的阶跃操控,并对采用该算法和传统方法所得结果进行对比。利用三维纳米位移台驱动样品分别在横向和轴向做周期阶跃移动,并采用传统方法和全息重构聚焦法对其分别进行跟踪测量。利用图1的实验装置首先对单个微球进行实验验证,采集到的图像如图2(a)所示,经过(2)式的运算后得到图2(b),再对其进行衍射计算得到(5)式的结果,对不同位置得到的重构强度进行分析,得出在图2(c)时是聚焦的位置。横向位置测量中,驱动样品使微球在横向上进行了10,5,2 nm的阶跃移动,实验结果如图3所示,可以明显看出采用全息重构聚焦法测得的结果在分辨力和噪声上均优于采用Hough变换法测得的结果,两种方法所得结果的标准差分别为0.5377 nm和1.706 nm。这是因为图2(c)重构后聚焦的强度图相比图2(b)的全息图信息更加集中,且经过去卷积运算消除了一部分噪声,因而得到的横向位置信息比传统方法更为精确。利用位移台使微球在轴向上同样进行了10,5,2 nm的阶跃移动,实验结果如图4所示,其标准差为1.4419 nm。由图3和图4可得,采用该算法对单个微球实现了2 nm的三维位移分辨力。

图 3. 对单个微球采用(a) Hough变换法和(b)全息重构聚焦法测得的横向阶跃位移

Fig. 3. Horizontal step displacement measured by (a) Hough transform method and (b) holographic reconstruction focusing method for single particle

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图 4. 单个微球轴向阶跃运动

Fig. 4. Axial step displacement of single particle

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4.2 交叠微球实验

对交叠微球进行测量,采集到的图像如图5(a)所示,经过(2)式运算后得到图5(b)所示结果,再对其进行衍射计算得到(5)式的结果,对不同位置得到的重构强度进行分析得出在图5(c)时是两个微球聚焦的位置,可以看出本来交叠的微球在重构后强度信息成功地分离。用三维纳米位移台驱动样品分别在横向和轴向做10,5,2 nm的周期阶跃位移,并对图像采用全息重构聚焦法对其进行跟踪测量。这时由于圆环强度的交错,传统方法已经无法得出其位置信息,而采用全息重构聚焦法对重构聚焦图像进行识别,得出横向测量结果如图6所示,对两个微球的位置进行平移以方便对比,可以看出两个微球的结果吻合较好,其中球1[图5(a)左侧]测量结果的标准差为0.5898 nm,球2测量结果的标准差为0.6722 nm。轴向实验结果如图7所示,同样实现了2 nm的轴向位移分辨力,其中球1测量结果的标准差为1.6320 nm,球2测量结果的标准差为1.8015 nm。从测量结果来看,采用该算法对单个微球的测量结果要优于对两个微球同时进行测量的结果,这是因为单个微球在重构时受噪声影响更小。

图 5. (a)交叠微球的全息图;(b)归一化后的交叠微球全息图;(c)交叠微球重构后的聚焦图像

Fig. 5. (a) Hologram of overlapped particles; (b) normalized hologram of overlapped particles; (c) focused image after reconstruction of overlapped particles

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图 6. 交叠微球的横向阶跃运动

Fig. 6. Horizontal step displacement of overlapped particles

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图 7. 交叠微球的轴向阶跃运动

Fig. 7. Axial step displacement of overlapped particles

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5 结论

本文提出了一种全息重构聚焦法,并将其应用于微球三维位置的测量中。对单个微球的测量,相较于传统方法,该方法对重构所得强度图进行去卷积运算,消除一部分噪声,使强度信息更加集中,从而能够更加精确地测量微球的横向位置。对于交叠的微球图像,经重构后也被成功地分离,从而实现对其定位。实验结果表明,此方法可以解决交叠微球位置测量的问题,对单个微球和交叠微球的测量都达到了2 nm的三维位移分辨力,为实现高准确性大通量微球三维位置并行测量提供了可能。