1 引言

生物传感器在医疗诊断、环境监测、国土安全等领域发挥越来越重要的作用^[1-2]。近年来,光栅传感技术迅猛发展,其具有抗电磁干扰、易于光纤系统兼容、可绕曲的特点,为研制新型生物传感器提供新选择^[3-4]。长周期光纤光栅(LPFG)满足相位匹配条件的是同向传输的纤芯模和包层模,而包层模极易受外界环境变化的影响,因此具有比布拉格光栅更高的折射率、温度、应力等灵敏度,LPFG自诞生以来就引起国内外学者的广泛关注^[5-6]。纳米膜修饰技术为LPFG生物传感器提供新的技术支持,可最大限度地保持生物分子活性,成为生物传感领域最受欢迎的一个研究方向^[7-8]。

对于覆膜光学类生物传感器,张志荣等^[9]采用数值计算方法仿真研究了生化反应生成复合物薄膜的折射率和厚度对LPFG耦合波长的影响。庄其仁等^[10]提出一种光栅传感器,将LPFG表面涂上硅化膜,根据谐振波长的改变判断血液中是否存在抗原,但该结构无法实现对抗原具体浓度的检测。传统生物传感器具有体积大、测试周期长、需要大量测试样本,以及指示剂有毒等缺点^[11-12]。

本文采用免标记共价固定的方法在LPFG表面制作纳米膜,结构简单、稳定性高、固定数量多、成本低^[13]。经纳米膜修饰的LPFG生物传感器可实现对抗原低浓度(质量浓度,下同)的定量检测。抗原浓度仅与光栅峰值损耗有关,浓度灵敏度高达2101.5 dB·mg^-1·mL且实验检测兔IgG最小浓度为0.0003125 mg·mL^-1。

2 理论基础

2.1 光栅表面折射率变化对LPFG谐振峰的影响

光波沿纤芯向前传播经过栅区时,纤芯中的基模耦合到同向传输的包层模中,造成部分光波能量损失,形成LPFG谐振峰。对于均匀单模LPFG,其相位匹配波长的表达式为

λ=(neffco-neffcl)Λ,(1)

图 1. 光栅表面折射率改变对LPFG谐振峰的影响

Fig. 1. Effects of the changes in the refractive index of the grating surface on the LPFG resonance peak

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式中:λ为谐振波长;Λ为光栅周期; neffco和 neffcl分别为纤芯基模和包层模的有效折射率。光栅表面折射率的变化将会引起包层模有效折射率的改变,最终导致LPFG谐振峰的改变。图1给出了LPFG谐振峰随光栅表面折射率变化的仿真结果,从图中可以看出,当光栅表面折射率逐渐增大时,LPFG谐振波长发生蓝移,峰值损耗减小。然而,LPFG作为折射率传感器,对于低折射率介质,其测量灵敏度非常低。针对这一问题,本文采用纳米膜修饰技术提高LPFG的敏感特性。

2.2 抗原抗体反应的比例特性

理论和实验都已经证明,免疫反应生成复合物的量与抗原浓度之间不是线性关系,参与生成复合物的抗原抗体分子数目存在如图2所示的比例关系^[14]。在抗体浓度固定时,伴随抗原浓度的逐渐增多,免疫反应生成复合物的沉淀量也在增多。当它们浓度比例达到最适值时,生成可见物的量最大,反应也最为彻底。当抗原浓度大于最适值后,生成可见物的量和反应速率反而急速下降。

图 2. 抗原抗体反应曲线

Fig. 2. Antigen-antibody reaction curve

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3 实验系统结构及其传感原理

长周期光栅生物传感器是利用单模光纤制成的光栅与它的检测器件同识别生物分子元件组成的生物传感器,将生物现象转化为能表征此现象的可分析的光电信号^[15]。实验系统主要由4部分组成(见图3),由内向外依次为写入LPFG的纤芯、包层、敏感薄膜、待测溶液。传感器表面的识别分子与待测生物分子发生的特异性结合反应改变了LPFG的某些光学特征,如生物物质对光的吸收^[16],从而影响LPFG中前向传输的包层模式,通过分析LPFG谐振峰的改变情况,完成对待测生物溶液浓度的检测。

图 3. 覆膜LPFG生物传感器结构示意图

Fig. 3. Schematic of the nanofilm-modified LPFG biosensor

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4 实验

4.1 敏感薄膜的制作

实验选用羊抗兔IgG作为敏感薄膜层中的识别生物分子,兔IgG作为待测生物溶液。1)将光栅放入2 mL浓硫酸中浸泡30 min,酸处理的目的是将光栅表面原有的惰性羟基进行激活,见图4(a),这是敏感薄膜形成的关键步骤^[17]。2)将光栅放入2 mL 三氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)中浸泡60 min,120 ℃烘箱共价固定120 min,使得APTES的硅官能反应基团与羟基经脱水缩合生成Si—O—Si化学键,见图4(b)。3)将光栅依次放入2 mL戊二醛中浸泡60 min,放入200 μL质量浓度为0.01 mg·mL^-1的羊抗兔IgG,在4 ℃下反应10 h,使得戊二醛一端的醛基与APTES的氨基发生共价结合反应,见图4(c),另一端醛基与羊抗兔IgG中的自由氨基反应生成C=N键^[18],见图4(d)。4)10 h后用物质的量浓度为0.01 mol·L^-1的磷酸盐(PBS)缓冲液反复清洗栅区,

图 4. 敏感薄膜的制作过程。(a)酸处理后的表面; (b) APTES修饰的表面; (c)醛基修饰的表面; (d)识别生物分子的固定

Fig. 4. Fabrication of the sensitive film. (a) Surface modified with sulfuric acid; (b) surface modified with APTES; (c) surface modified with glutaric dialdehyde; (d) immobilization of the identifying biomolecules

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然后用200 μL质量分数为5%牛血清白蛋白(BSA)覆盖栅区,37 ℃水浴反应30 min,使光栅表面未反应的醛基完全反应,避免抗体的非特异性吸附。将识别生物分子通过共价键结合的方式固定到光栅表面,完成纳米膜的制作。

4.2 实验样本选取

为了保证实验精度,选取三组不同周期的光栅,每组配制不同浓度的兔IgG溶液,羊抗兔IgG的质量浓度设置为固定值0.01 mg·mL^-1,待测样本浓度如表1所示。选取的待测样本溶液,其浓度梯度变化范围比较小,导致对应折射率的变化也较小,所以在选取的待测样本溶液浓度范围内,可近似认为折射率不变。

4.3 免疫反应

图 5. 显微图像。(a)实验前光栅栅区; (b)免疫反应后覆膜LPFG生物传感区

Fig. 5. Microscopic images. (a) Grating area before the experiment; (b) nanofilm-modified LPFG biosensing area after the immunoassay

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首先量取200 μL 1号样本溶液覆盖LPFG生物传感区,37 ℃水浴反应30 min,然后用物质的量浓度为0.01 mol·L^-1的PBS缓冲液反复清洗栅区,氮气吹干,最后连接光源和光谱仪,保存实验数据。重复以上步骤,依次完成2~11号样本的免疫反应实验。图5为实验前光栅栅区和免疫反应后覆膜LPFG生物传感区的显微图像。

5 实验结果和分析

5.1 化学处理对LPFG谐振峰的影响

以周期500 μm的光栅为例,图6为敏感薄膜制作过程中前期化学处理对LPFG谐振峰的影响。由图6可知,酸处理仅激活了光栅表面的惰性羟基,没有改变光栅的参数,因此谐振峰没有发生变化。LPFG经氨基和醛基处理后,其表面附着了具有一定折射率的APTES和戊二醛,改变了光栅外包层的折射率,使得LPFG的谐振波长发生蓝移且峰值损耗减小,实验结果与理论仿真相符。因戊二醛和APTES的折射率非常接近,所以醛基处理后谐振峰的变化较小。

图 6. 前期化学处理对LPFG谐振峰的影响

Fig. 6. Effects of the pre-chemical treatments on the resonance peak of LPFG

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5.2 免疫反应对覆膜LPFG谐振峰的影响

图7为免疫反应对周期为445 μm覆膜LPFG生物传感器谐振峰的影响。由图可知,当羊抗兔IgG质量浓度为固定值0.01 mg·mL^-1时,随着兔IgG浓度逐渐增加,LPFG峰值损耗先是明显减小,而当兔IgG浓度由0.0075 mg·mL^-1继续增加时,峰值损耗反而开始逐渐增加。峰值损耗的变化趋势与抗原抗体反应生成复合物量的比例性特点相符。LPFG峰值损耗随兔IgG浓度的变化曲线如图8所示,在LPFG峰值损耗减小区间内,将兔IgG浓度和其对应的峰值损耗进行线性拟合,计算得出,周期为445 μm 覆膜LPFG生物传感器的浓度灵敏度为2101.5 dB·mg^-1·mL。

图 7. 免疫反应对Λ=445 μm LPFG谐振峰的影响。(a)兔IgG浓度为0.0025~0.0075 mg·mL-1; (b)兔IgG浓度为0.0075~0.0300 mg·mL-1

Fig. 7. Effects of the immunoassay on the resonance peak of LPFG at Λ=445 μm. (a) Concentration of rabbit IgG with 0.0025-0.0075 mg·mL-1; (b) concentration of rabbit IgG with 0.0075-0.0300 mg·mL-1

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图 8. Λ=445 μm峰值损耗随兔IgG浓度的变化曲线

Fig. 8. Peak loss of LPFG at Λ=445 μm with different rabbit IgG concentrations

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因周期为460 μm和500 μm LPFG生物传感器随兔IgG浓度的增加,其谐振峰图形的变化规律与周期445 μm一样,所以只给出兔IgG浓度变化对周期为460 μm和500 μm LPFG峰值损耗的影响曲线,如图9所示。在LPFG峰值损耗减小区间内,同样对兔IgG浓度和其对应的峰值损耗进行线性拟合,计算得出,周期460 μm和500 μm LPFG生物传感器对应的浓度灵敏度分别为1306.5 dB·mg^-1·mL和575.9 dB·mg^-1·mL。

图 9. LPFG峰值损耗随兔IgG浓度的变化曲线。(a)Λ=460 μm; (b)Λ=500 μm

Fig. 9. Peak loss of LPFG with different rabbit IgG concentrations. (a) Λ = 460 μm; (b) Λ = 500 μm

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由以上实验结果得出,对于此三种不同周期的覆膜LPFG生物传感器,在峰值损耗减小区间内,周期为445 μm LPFG生物传感器的浓度灵敏度最高。由LPFG理论可知,光栅周期越小,纤芯基模耦合到同向传输包层模的能量越多,而包层模极易受外界因素影响,因此光栅周期越小,传感器的灵敏度越高。结合三种不同周期的LPFG峰值损耗随兔IgG浓度的变化曲线,根据抗原抗体反应比例性特点,计算得出,与0.01 mg·mL^-1羊抗兔IgG发生免疫反应的最适兔IgG浓度为0.0075 mg·mL^-1。

5.3 实验结果分析

实验证实,免疫反应只改变了覆膜LPFG生物传感器谐振峰的峰值损耗大小,而对谐振波长没有影响。免疫反应生成的复合物很薄且是单分子排列,其折射率与敏感薄膜折射率非常接近,传感器表面折射率改变量极小,因此LPFG生物传感器谐振波长没有发生变化。但是随着抗原浓度的增加,覆膜LPFG生物传感器谐振峰的峰值损耗先减小后增加,主要原因是由于LPFG峰值损耗大小与生成免疫复合物的量有关。本实验羊抗兔IgG浓度固定,当兔IgG浓度小于免疫反应最适浓度时,随着兔IgG浓度的增加,免疫复合物量也在增加,在光栅传感器的电场空间布局中,生成免疫复合物的量越大,LPFG包层对模式的约束力越大,包层模电场在纤芯中的强度将减小,导致纤芯模与包层模式的互耦合系数减小,进而使LPFG峰值损耗变小;当兔IgG浓度继续增加至最适浓度时,生成免疫复合物的量达到最大值,LPFG的峰值损耗达到最小值;随着兔IgG浓度继续增加,此时抗原浓度超过了免疫反应的最适浓度值,生成复合物的量呈减少趋势而不是继续增加,其对LPFG峰值损耗的影响同免疫复合物量增加的过程相反,即最终导致LPFG峰值损耗变大。

由图8、图9可看出,抗原浓度与覆膜LPFG峰值损耗存在着特殊的曲线关系,即一个峰值损耗对应两种不同浓度的抗原。在实际应用中,可根据待测抗原的可能浓度范围确定具体的浓度值,也可采用加倍稀释工艺来确定,因两种不同浓度的生物溶液稀释后发生的免疫反应对覆膜LPFG峰值损耗的影响趋势恰好相反,结合待测生物溶液稀释前后对应的峰值损耗即可确定抗原的具体浓度。

6 结论

基于LPFG折射率传感特性,提出一种覆膜LPFG免标记生物传感器,利用共价键结合的方式把识别生物分子固定到传感器表面,通过待测生物溶液与识别分子发生的免疫反应对LPFG生物传感器谐振峰的影响,实现了对生物溶液的低浓度测量。在LPFG表面制作纳米膜可大大提高LPFG的低浓度灵敏性,显著改善LPFG的传感性能。实验结果显示,待测抗原浓度仅与覆膜LPFG峰值损耗有关,浓度灵敏度高达2101.5 dB·mg^-1·mL且本次实验测得兔IgG最小浓度为0.0003125 mg·mL^-1。待测生物分子无需标记,可用于直接检测,大大降低了实验成本,最大限度地保持了蛋白质的活性和测量人员的安全,同时该传感器还具有稳定性高、抗电磁干扰、结构简单等优点,在生化传感领域,发挥着越来越大的作用,拥有良好的应用前景。传感器的重复性、一致性是传感系统设计的一个重要内容,包括对所制备的传感器进行循环测试、性能评估、表面活性再生处理以及传感单元解调等方面的研究,在未来的研究中,课题组将对此作进一步分析实验。