偏振荧光显微成像技术及研究进展（特邀）

生命体是由大量有机排列的分子组成的，其结构不仅与分子的位置分布有关，还与分子的排列方式和空间取向有关。偏振荧光显微成像技术利用荧光的偏振特性，能够对生物结构的分子取向进行观测和成像，进而从分子层面揭示生命活动的功能和代谢信息，有力推动了生物医学相关领域的研究和发展。本文从偏振荧光成像原理出发，对目前存在的多种偏振荧光显微成像技术进行原理介绍和现状分析，列举了其在生物医学领域的相关应用，讨论了其发展趋势及前景，旨在为该领域的科研人员了解偏振荧光显微成像技术提供参考。

Abstract

Organisms are composed of molecules typically arranged and oriented in order. The structures of organisms are related to the positional distribution of molecules and their spatial orientation. Polarized fluorescence microscopy (PFM) is such an imaging tool that facilitates the sense and observation of the molecule orientation in biological samples by utilizing fluorescence polarization, enabling the revealing of functional and metabolic information beyond fluorescence intensity provided by more traditional fluorescence microscopy. In this review, we first briefly describe the theory and principle of PFM and then introduce several implementations of PFM on different microscopic modalities. We later summarize its applications in the field of biomedical research and finally discuss its potential future directions.

1　引言

荧光显微技术可以对生命活动进行细胞、亚细胞水平的观测，已经成为生命科学、医学研究，以及药物开发等领域的重要成像工具^［1-2］。荧光显微技术通常利用荧光探针特异性地标记生物体内的特定结构，并对荧光信号进行探测和成像，从而获取生命体结构和功能相关的信息。荧光的基本物理指标通常包括反映荧光浓度的强度、与吸收和发射光谱相关的波长、与荧光衰减寿命相关的时间和与偶极子取向关联的偏振^［3］。近些年来，荧光显微技术在时空分辨率^［4-6］、光谱分析^［7-8］、荧光寿命成像^［9-10］等方面的性能不断提升，进一步拓展了其在生物医学研究中的应用。与此同时，对荧光偏振信息的利用^［11］，进而研发新型的基于偏振调制的荧光显微成像技术，也获得了越来越广泛的关注^［12-13］。

从经典物理的观点看来，荧光分子可以看作一个具有方向性的偶极子，一定测量时间和空间内的大量荧光偶极子的集合可以看作取向分布函数^［14-16］。当靶向生物分子被荧光分子稳定标记时，荧光分子的取向反映其标记的生物结构的分子取向，通过对荧光偏振的检测和成像可以获取靶向生物结构的取向等生命活动相关信息^［17-19］。另一方面，荧光的偏振特性也可以用于激发和成像调制，实现图像的稀疏性增强，再通过算法重构提升成像的分辨率，达到超分辨的效果^［20-22］。

自20世纪50年代荧光偏振用于分析荧光溶液以来，荧光偏振显微技术经历了长足的发展。从偏振调制的角度来看，涵盖了基于激发端的荧光偏振调制技术^［23-25］和基于辐射端的荧光调制技术^{［17，26］}。从荧光偏振调制和显微成像结合的角度来看，既提出并完善了一系列基于偏振的成像理论和模型^{［14-16，27-28］}，又将荧光偏振与众多显微技术相结合开发了一系列偏振荧光显微成像系统。所形成的偏振荧光显微技术包括：从宽场显微镜^{［24-25，29］}到共聚焦^［30-32］、光片显微镜^［33-35］；从单光子激发到双光子激发^［36-39］；从衍射极限内成像到超分辨成像^{［20-21，40］}；从分子取向的二维平面解析^{［18，41］}到三维空间解析^{［34，42-44］}。相关的生物应用也拓展到了细胞和亚细胞尺度^［45-46］，比如微管^［18］、膜蛋白^［32］、肌球蛋白^［33］等微纳结构，研究对象包括从真菌^{［24，29］}、离体细胞^{［18，25］}到小动物胚胎^［33］等众多生物体。

本文旨在帮助研究者们了解偏振荧光显微成像技术的基本原理、技术现状、应用场景和发展趋势，为该领域科学研究提供参考。首先从偶极子模型、偏振成像调制方法、空间-角度表征等3个方面，介绍偏振荧光成像的基本原理；其次分类论述基于荧光偏振调制的显微成像技术及其最新进展，既包含基于荧光偏振的分子取向成像技术，也包含基于偏振调制的分辨率提升技术；然后整理并列举了偏振荧光显微技术在生物医学中的相关应用；最后对偏振荧光显微技术进行了总结，并展望了其未来发展方向。

2　偏振荧光成像原理

偏振作为荧光分子的一项重要指标，可以间接测量荧光偶极子取向，而荧光偶极子取向是反映潜在亚细胞器结构的重要指标。偏振荧光显微技术的相关理论也在不断地更新和完善，从荧光辐射过程中荧光各向异性的测量原理^［3］发展到荧光吸收过程中荧光线性二向色性的测量原理，并于近期形成更为完善的偏振成像空间-角度表征理论^［14-16］。

2.1　荧光的偏振特性

荧光物体的吸收和辐射通常被视为各向同性，即单极子近似，因此显微镜研究人员通常采用光学点扩散函数或者光学传递函数来描述荧光显微成像系统。光学点扩散函数是光学系统对各向同性点光源的辐照度响应，无法对各向异性的偶极子辐射体的响应进行有效的建模，如仅采用单极子进行建模可能会导致去卷积过程中出现有偏估计^［14］。因此采用偶极子或者更高阶模型对荧光偏振特性进行建模是十分必要的。

如果把荧光分子吸收和辐射光子的过程看作偶极子，那么从经典物理学角度出发，荧光偶极子吸收过程的吸收率^{［3，12，47］}可以描述为

η_{a b s o r p t i o n} \propto | e_{a b s o r p t i o n} \cdot μ_{a b s o r p t i o n} |^{2} \propto c o s^{2} θ

，（1）

式中： $η_{a b s o r p t i o n}$ 为荧光偶极子吸收率； $e_{a b s o r p t i o n}$ 为激发光对应的电场； $μ_{a b s o r p t i o n}$ 为荧光偶极子的吸收偶极矩； $θ$ 为 $e_{a b s o r p t i o n}$ 和 $μ_{a b s o r p t i o n}$ 之间的夹角。从式（1）可以得出，荧光偶极子吸收率 $η_{a b s o r p t i o n}$ 正比于夹角 $θ$ 余弦值的平方。当激发光偏振方向垂直于偶极子方向时，荧光偶极子吸收率最低；当激发光偏振方向平行于偶极子方向时，荧光偶极子吸收率最高。

而对于荧光偶极子辐射过程，荧光偶极子远场辐射的电场可以描述^［12］为

e_{e m i s s i o n} \propto k \times (k \times μ_{e m i s s o n})

，（2）

式中： $e_{e m i s s i o n}$ 为荧光偶极子辐射对应的电场； $k$ 为光的传播方向； $μ_{e m i s s i o n}$ 为荧光偶极子的辐射偶极矩。定义 $μ_{k}$ 为第 $k$ 个探测方向，则荧光显微镜荧光偶极子辐射率可以表示为

η_{e m i s s o n} \propto | e_{e m i s s i o n} \cdot μ_{k} |^{2}

。（3）

上述荧光分子采用偶极子进行建模，式（1）和式（3）分别体现出荧光吸收和辐射过程中各方向能量分布不均一的偏振相关特性。

2.2　偏振成像调制方法

第2.1节主要讨论采用荧光偶极子模型来描述荧光的偏振特性时，由经典物理描述可以得出偏振特性在荧光吸收和辐射过程中均有相应的表现。最初偏振荧光显微成像技术依据荧光辐射过程中的偏振特性，尤其是荧光各向异性（FA）来对荧光的偏振特性进行定量分析，从而获取生物大分子的取向信息及其动态变化。并且测量荧光的各向异性可以了解生物体内荧光分子的荧光共振能量转移（FRET）情况，从而研究生命活动相关现象^［48-52］。荧光各向异性是指荧光辐射时表现出各个方向能量不均等的各向异性，该特性可采用经典物理中偶极子理论进行解释。当荧光团被激发出荧光时，荧光偏振方向与电偶极矩方向相互垂直。而生物样本中包含大量电偶极矩不一致的荧光团，因此具有偏振特性的荧光一般是部分偏振光，荧光各向异性是大量荧光团综合作用的结果。

荧光的各向异性通常有两种描述方式^［3］。激发光路中圆偏振激发光照射荧光标记生物样本，探测光路荧光偏振可以分解为互相垂直的两个方向的光强，即平行于激发光路的光强 $I_{∥}$ 和垂直于激发光路的光强 $I_{⊥}$ 。当激发光相对于生物样本处于最佳偏振方向时，定义荧光偏振系数来反映荧光的偏振程度：

p = \frac{I_{‖} - I_{⊥}}{I_{‖} + I_{⊥}}

，（4）

或者定义荧光各向异性系数来反映荧光的各向异性程度：

r = \frac{I_{‖} - I_{⊥}}{I_{‖} + 2 I_{⊥}}

。（5）

各向异性系数在荧光各向异性测量中应用较为广泛。然而在实际测量中，由于检偏器和两支光路对两个偏振方向的检偏性能有差异， $I_{⊥}$ 和 $I_{∥}$ 的测量值和真实值会有所偏差，荧光各向异性系数公式需要引入一个差异系数 $g$ 来进行校正。校正后的各向异性系数为

r = \frac{I_{‖} - g I_{⊥}}{I_{‖} + 2 g I_{⊥}}

，（6）

式中： $I_{⊥}$ 和 $I_{‖}$ 分别为对应偏振方向的光强测量值； $g = \frac{I_{‖}}{I_{⊥}}$ ， $g$ 因子为只和测量系统有关的差异系数，即其对于同一系统是不变的。因此测得光学系统的 $g$ 因子和两个偏振方向的光强 $I_{‖}$ 与 $I_{⊥}$ 即可以计算出荧光的各向异性系数。图1（a）展示了利用荧光各向异性实现偏振荧光显微成像的典型系统。

荧光偏振成像调制方法典型系统［53］及偏振成像空间-角度表征理论示意图。（a）基于荧光各向异性的偏振荧光显微成像典型系统；（b）基于线性二向色性的偏振荧光显微成像典型系统；（c）实球谐函数直观图；（d）常数球谐函数（左侧）、旋转对称球谐函数（中间）和非旋转对称球谐函数（右侧）直观图

图 1. 荧光偏振成像调制方法典型系统^［53］及偏振成像空间-角度表征理论示意图。（a）基于荧光各向异性的偏振荧光显微成像典型系统；（b）基于线性二向色性的偏振荧光显微成像典型系统；（c）实球谐函数直观图；（d）常数球谐函数（左侧）、旋转对称球谐函数（中间）和非旋转对称球谐函数（右侧）直观图

Fig. 1. Typical systems of fluorescence polarization imaging modulation method^[53] and schematic diagrams of polarization imaging space-angle characterization theory. (a) Typical system of polarized fluorescence microscopy imaging based on fluorescence anisotropy; (b) typical system of polarized fluorescence microscopy imaging based on linear dichroism; (c) intuitive diagram of real sphere harmonics; (d) constant sphere visual diagram of harmonics (left), rotationally symmetric spherical harmonics (middle), and non-rotationally symmetric spherical harmonics (right)

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然而荧光分子的旋转和荧光分子的荧光共振能量转移通常会导致生物样本荧光辐射存在去极化现象，使得荧光各向异性表现较微弱，从而影响对于荧光分子偶极子取向的测定。这些都极大地限制了基于荧光辐射过程中荧光各向异性的测量技术的相关应用，因此荧光吸收过程中的偏振特性能否用作偶极子取向信息及其动态变化的测量是备受关注的问题。图1（b）中，研究人员依据荧光吸收过程中的偏振特性，提出了荧光线性二向色性（LD）偏振显微成像技术，克服了基于荧光辐射过程中荧光各向异性测量技术易受去极化影响的缺陷。荧光线性二向色性偏振显微成像技术通常使用线偏振光激发生物样本，可以采用经典物理中偶极子理论对其进行描述。荧光分子可以看作偶极子，线偏振光照射在荧光分子上，其被激发出荧光的概率正比于电偶极矩方向和激发光偏振方向夹角的余弦值的平方（ $c o s^{2} θ$ ）。当电偶极矩方向与激发光偏振方向平行时，荧光分子被激发出荧光的概率最大；而当电偶极矩方向与激发光偏振方向垂直时，荧光分子不能被激发出荧光。因此荧光线性二向色性偏振显微技术利用荧光吸收过程中荧光分子对于偏振光方向的选择性，可以避免受到FRET去极化影响。该技术通常采用互相垂直的线偏振光作为激发光，通过测定不同方向的线偏振激发光对应的荧光辐射强度之比来测定生物样本中偶极子取向信息及其动态变化^［23］。

2.3　偏振成像的空间-角度表征理论

荧光各向异性和线性二向色性偏振显微成像技术已被广泛用于成像蛋白质聚集体、细胞纤维结构和细胞膜中的生物分子取向分布测量。然而，这两种技术并不能获得整幅图像中完整的取向顺序信息，仅限于已知分子平均取向先验的部分样品。随着偏振荧光显微成像技术的不断成熟，与其相关的偶极子成像理论也在不断完善，实现了从偶极子取向的二维平面解析^{［18，41］}到三维空间解析^{［34，42-44］}的跨越，对于偏振显微成像系统的发展有着极其重要的指导意义。

偶极子的二维空间解析通常着眼于二维或三维空间强度分布和二维平面偶极子角度分布重构，但当考虑该重构问题的空间部分时，基本都采用忽略空间重构问题^{［17，19，24，54］}或者假设空间和角度重构问题可以依次求解^［18］这两种处理方式。为了实现偶极子的三维空间解析，2019年Chandler等^［14-16］提出空间-角度荧光显微镜的基本理论，为分析对单个荧光偶极子和标记生物分子的重叠偶极子集合进行成像的系统提供了统一的框架。该理论从希尔伯特空间出发，对消球差透镜进行建模，Chandler等^［14］推导出了空间-角度显微镜的成像模型，即

g (r_{d}) = \int_{s^{2}} d {\hat{s}}_{o} \int_{ℝ} d r_{o}^{‖} \int_{ℝ^{2}} d r_{o}^{⊥} h (r_{d} - r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}, {\hat{s}}_{o}) f (r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}, {\hat{s}}_{o})

，（7）

式中： $g (r_{d})$ 是采集到的生物样本图像数据中对应位置 $r_{d}$ 处的灰度值； $r_{o}^{‖}$ 和 $r_{o}^{⊥}$ 分别是 $r_{o}$ 的横向坐标分解和纵向坐标分解； $h (r_{d} - r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}, {\hat{s}}_{o})$ 是单位浓度距离为 $r_{d} - r_{o}$ 、角度朝向为 ${\hat{s}}_{o}$ 的荧光分子响应即偶极子点扩散函数，满足 $\int_{S^{2}} d {\hat{s}}_{o} \int_{ℝ^{2}} d r h (r, 0, {\hat{s}}_{o}) = 1$ ； $f (r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}, {\hat{s}}_{o})$ 是生物样本在空间位置 $r_{o}$ 处角度朝向为 ${\hat{s}}_{o}$ 的荧光分子浓度； $S^{2}$ 表示球面空间； $R$ 和 $R^{2}$ 表示三维空间子空间。

接下来采用球谐基对偶极子空间-角度成像模型进行描述，即对式（7）利用球面函数广义Plancherel定理，可以得到一组偶极子角度传递函数相关公式：

\begin{matrix} g (r_{d}) = \sum_{𝓁 = 0}^{\infty} \sum_{m = - 𝓁}^{𝓁} \int_{R} d r_{o}^{‖} \int_{ℝ^{2}} d r_{o}^{⊥} H_{𝓁}^{m} (r_{d} - r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}) \times \\ F_{𝓁}^{m} (r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}) \end{matrix}

，（8）

H_{𝓁}^{m} (r_{d} - r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}) = \int_{S^{2}} d {\hat{s}}_{o} h (r_{d} - r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}, {\hat{s}}_{o}) Y_{𝓁}^{m *} ({\hat{s}}_{o})

，（9）

F_{𝓁}^{m} (r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}) = \int_{S^{2}} d {\hat{s}}_{o} f (r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖}, {\hat{s}}_{o}) Y_{𝓁}^{m *} ({\hat{s}}_{o})

，（10）

式中： $H_{𝓁}^{m} (r_{d} - r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖})$ 为偶极子角度传递函数，满足归一化条件 $\int_{ℝ^{2}} d r H_{0}^{0} (r, 0) = 1$ ； $F_{𝓁}^{m} (r_{o}^{⊥}, r_{o}^{‖})$ 为偶极子角度谱； $Y_{𝓁}^{m *} ({\hat{s}}_{o})$ 表示球谐函数。为了方便直观理解，图1（c）给出了 $l = 0$ 和 $l = 2$ 时的实球谐基函数。且球面上的平方可积函数可以写成球谐函数的加权和，左侧 $l = 0$ 且 $m = 0$ 的球谐函数表示常数函数，中间 $m = 0$ 的球谐函数表示旋转对称函数，右侧 $m \neq 0$ 的球谐函数表示非旋转对称函数，如图1（d）所示。

3　基于偏振调制的荧光显微成像技术

为了满足生物医学相关领域对生物细胞器或者生物大分子等结构信息和生物样本更高分辨率强度信息的需求，显微成像研究人员将光学偏振调制引入不同荧光显微成像系统^［11］。根据荧光显微成像技术类型进行分类，分别讨论不同类型偏振调制荧光显微技术的研究进展，着重讨论单分子取向定位显微技术和基于偏振调制的分辨率增强显微技术的相关发展。

3.1　宽场偏振荧光显微技术

基于荧光吸收过程中荧光线性二向色性的偏振显微成像技术最早出现在宽场荧光显微镜中^{［23，55-57］}。2006年，Vrabioiu等^［24］采用偏振宽场荧光显微镜研究活酵母菌隔膜蛋白的结构。在此工作基础上，2011年DeMay等^［25］提出一种用于测量高时空分辨率下绿色荧光蛋白偶极矩取向的偏振荧光显微成像系统。该研究团队采用宽场偏振荧光显微镜对棉蚜内隔膜蛋白进行成像，发现其隔膜蛋白环是有序的。2015年，Abrahamsson等^［29］将多焦点成像技术与偏振荧光显微镜相结合，开发了一种可以用于活体生物样本的瞬时三维多焦点偏振荧光显微镜（MF-PolScope），实现了多个偏振态和多达25个焦平面的同时成像，如图2所示，MF-PolScope在单次快照中可以获取由多个同时形成的二维焦平面组成的瞬时三维图像。

图 2. 多焦点偏振荧光显微技术示意图^［29］。（a）~（c）多焦点偏振荧光显微镜实验装置和原理示意图；（d）采用不同偏振态的激发光激发生物样本从而获取其偏振信息

Fig. 2. Schematic diagrams of multifocus polarized fluorescence microscopy^[29]. (a)‒(c) Multi-focus polarized fluorescence microscope experimental device and schematic diagram; (d) using excitation light with different polarization states to excite biological samples and obtain their polarization information

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3.2　共聚焦偏振荧光显微技术

共聚焦荧光显微技术通过针孔排除失焦光解决了传统宽场显微镜焦面模糊的问题，可以更好地与偏振调制结合实现较精确偶极子取向探测。2003年，Bigelow等^［30］设计并实现了可用于荧光各向异性成像的激光扫描共聚焦荧光成像系统。其中，荧光各向异性成像是通过放置在传统针孔后面的偏振分束器来实现的，光电倍增管用于同时检测两个正交方向的偏振光。2013年，Kress等^［31］将偏振荧光显微技术引入共聚焦荧光显微镜，提出共聚焦偏振荧光显微技术。该技术能够量化任意形状的细胞膜中的分子取向顺序，并显示其与局部亚衍射尺度形态、局部脂质环境和膜刚度的关系，提供了一种研究细胞膜复杂且异质分子组织的新工具。旋转的半波片（HWP）用于实现激发光偏振方向的变化，1/4波片（QWP）用于补偿激发光路中二向色镜导致的椭圆形畸变，如图3（a）所示。该共聚焦偏振荧光显微镜对于生物分子取向的测量能力在巨型单层囊泡（GUVs）上得到了验证，如图3（c）所示。随后，Wang等^［32］对此成像系统进行改进，提出一种高帧率荧光共焦角分辨线性二色性显微镜，如图3（d）所示，该成像系统使用高度并行的共聚焦图像采集系统和电光调制器快速偏振切换单元来提高原成像系统的采集速率，其采集速率高达每秒数百帧，并在巨型囊泡和COS-7细胞上进行了实验验证。

图 3. 共聚焦偏振荧光显微技术示意图^［31-32］。（a）共聚焦偏振荧光显微镜装置图；（b）取向分布函数和角度的定义；（c）在巨型单层囊泡上的验证实验；（d）共聚焦偏振荧光显微技术的改进

Fig. 3. Schematic diagrams of confocal polarized fluorescence microscopy^[31-32]. (a) Diagram of confocal polarized fluorescence microscopy device; (b) definition of orientation distribution function and angle; (c) verification experiment on giant unilamellar vesicles; (d) improvement of confocal polarized fluorescence microscopy technology

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3.3　光片偏振荧光显微技术

传统宽场荧光显微镜光漂白效应和光毒性明显且容易被离焦背景影响成像对比度，而光片荧光显微镜有效地解决了宽场显微镜的以上问题。与传统显微镜不同，光片荧光显微镜采用片状光激发生物样品，并利用与片状光垂直的探测光路对荧光进行收集。其中，片状光只激发成像平面的荧光分子而不激发生物样本的离焦部分，因此光片荧光显微镜对生物样本的光毒性和光漂白效应较小且具有更高的轴向分辨率，被生物医学等领域研究者广泛使用。并且光片荧光显微镜以片状光面扫描的天然优势，能够实现生物样本的三维快速成像。2018年，Markwardt等^［33］首次将偏振荧光成像应用于光片显微技术，实现了对活体线虫胚胎的肌球蛋白能量共振转移和磷酸化过程的观测。随后他们进一步将偏振调制技术拓展到多视角成像系统，基于空间-角度偶极子成像理论提出一种双视角倒置偏振光片荧光显微技术^［34-35］，并通过Tikhonov正则和奇异值分解求解逆问题首次实现荧光分子的三维空间强度和三维分子取向的联合重构。激发光路采用液晶偏振片来改变激发光偏振态，当第一个视角偏振光激发荧光时，第二个视角采集成像，而后第二个视角偏振光激发荧光，第一个视角采集成像，如此交替进行，如图4所示。双视角光片荧光显微镜可以实现三维各向同性分辨率成像，结合偏振调制对荧光偶极子角度分布的编码，可以实现三维荧光偶极子取向测量。然而实验结果表明，为了抑制噪声而引入的Tikhonov正则项会导致偶极子角度取向分布重构出现估计偏差。随后浙江大学刘华锋和郭敏课题组^［58］尝试将激发光偏振态和角度分布两个维度引入传统Richardson‑Lucy算法，提出一种基于广义Richardson-Lucy算法的荧光分子空间和角度分布重建方法，该方法无需添加额外的正则项，仅通过偏振光片荧光显微镜数据即可对荧光分子偶极子空间和角度分布进行更好的重建。此外，该方法基于球谐域的计算过程将极大地减少重建算法中前后投影和球面域乘除法的计算成本，解决了现有Tikhonov正则和奇异值分解方法噪声抑制能力差、经验调整参数繁琐、重建结果空间分辨率低和角度分布不准确的问题。

图 4. 双视角非对称倒置偏振光片荧光显微技术示意图^［34-35］。（a）显微镜示意图，液晶偏振片以红色突出显示；（b）非对称NA物镜；（c）低NA物镜沿暗蓝色轴激发；（d）高NA物镜与低NA物镜的自由度相同

Fig. 4. Schematic diagrams of dual-view polarized light sheet microscopy with asymmetric detection objectives^[34-35]. (a) Overview of the microscope with liquid crystal polarizers highlighted in red; (b) asymmetric detection objectives; (c) excitation from the low-NA objective along the dark-blue axis; (d) excitation from the high-NA objective is controlled with the same degrees of freedom as the low-NA objective

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3.4　双光子偏振荧光显微技术

2007年，马辉课题组^［36］在双光子荧光显微镜中利用荧光各向异性表征生物分子的旋转动力学和相互作用。其中，由线偏振激发光激发的双光子荧光被分成平行的和垂直的偏振分量，两个探测器对其同时探测，从而可以由激发光偏振态和对应荧光偏振的不同组合图像得出反映荧光各向异性的图像。传统荧光各向异性测量一般需要已知分子的角度分布先验（如平均取向），这一要求极大地限制了传统偏振荧光显微镜的应用。为了突破角度分布先验的限制，如图5所示，Gasecka等^［37］将偏振调制与双光子显微镜相结合，提出一种偏振双光子显微技术，来定量测量脂质和细胞膜中的局部静态分子取向。相较于单光子激发，双光子激发能够实现更少的散射、更深的穿透深度、更好的空间分辨率和更高的偏振测量角度灵敏度。理论推导表明，单分子双光子激发概率与 ${|μ \cdot E (α)|}^{4}$ 成正比，其中， $μ$ 为吸收偶极子， $E$ 为入射光场。给定偏振态 $i$ ，取向函数 $f (θ, ϕ)$ 内的分子集合的时间平均荧光强度可以表示为

图 5. 双光子偏振荧光显微技术示意图^［37］。（a）双光子偏振荧光显微系统示意图；（b）坐标定义示意图

Fig. 5. Schematic diagrams of two-photon polarization fluorescence microscopy^[37]. (a) Schematic diagram of two-photon polarized fluorescence microscopy system; (b) schematic diagram of coordinate definition

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\begin{array}{l} I_{i} (ρ, η, α, ν) = \int_{0}^{2 π} \int_{0}^{π} {|μ_{i} (θ, ϕ, ρ, η) \cdot E (α)|}^{4} \times \\ J_{i} (θ, ϕ, ρ, η) \times f (θ, ϕ) s i n θ d θ d ϕ \end{array}

，（11）

式中： $E (α)$ 为相对于X轴偏转 $α$ 的线偏振光矢量； $α$ 取值范围为 $0$ ~ $2 π$ 。与基于荧光各向异性的偏振显微技术相比，该技术利用偏振角度 $α$ 整个取值范围并将 $ρ$ 、 $η$ 和 $μ$ 作为拟合参数，可以完整分析偶极子的取向分布。随后，Lazar等^［38］发现双光子偏振荧光显微镜（2PPM）检测到的荧光蛋白线性二向色性的灵敏度明显高于单光子显微镜，并提出了基于线性二向色性的双光子偏振荧光显微技术。该技术通过在传统双光子荧光显微镜上添加偏振调制器来实现，可以检测到大多数荧光蛋白标记的膜蛋白中的线性二向色性现象，为活细胞中分子过程可视化和分析提供了重要方法。然而2PPM技术比较依赖待观察细胞的形状和取向，更容易测量具有水平或垂直方向长截面轮廓的细胞。2014年，Ferrand等^［59］从数学上证明了至少需要五次偏振测量才能达到取向测量最佳水平，并且提出了一种可以提供高达四阶对称性方向分布的数据处理方法，从而完善了基于荧光二向色性的双光子偏振荧光显微技术的相关理论。

3.5　宽场超分辨分子取向显微技术

偏振荧光显微镜旨在检测荧光团的偶极子取向，但是通常会受到衍射极限的影响，只能获取到衍射极限体积内大量偶极子的平均取向。为了解决此问题，2016年北京大学席鹏研究团队^［21］研发了一种基于偏振调制的超分辨偶极子取向分布重建方法（SDOM），该方法可以解析亚衍射极限体积内更少数量的偶极子的有效取向。基于宽场荧光显微镜，SDOM技术通过连续旋转激光器前半波片来实现旋转线偏振激发，EMCCD相机收集从不同偏振激发角度激发的一系列荧光图像，如图6（a）所示。席鹏团队应用该技术来解析固定细胞和活细胞中的结构细节，并首次证明树突棘颈部的不同边界表现出偶极子取向的异质分布。2019年，席鹏课题组^［18］将宽场结构光照明与荧光偏振调制相结合，开发了一种偏振结构照明显微镜（pSIM），如图6（b）所示。pSIM技术将偏振激发看作角度维度上的结构化照明，通过在空间-角度超空间中分析来获得空间超分辨结构和偶极子取向，在保留偶极子取向的测量精度和灵敏度的基础上分辨能力提升了一倍，成功对固定细胞、组织切片和活细胞中细胞骨架丝的偶极子方向进行了超分辨率成像。2023年，该课题组^［60］利用数字微镜器件（DMD）的自偏振维持能力和电光调制器（EOM）的偏振调制能力，提出一种新型高速自偏振同步调制3DSIM系统，该系统在实现三维高速超分辨成像的同时还能够精确确定荧光偶极子的取向。此外，该课题组研究人员^［44］在宽场偏振调制和倾斜照明显微镜的基础上进一步提出三维取向映射（3DOM）显微技术，该技术通过提取倒易空间中六个偏振调制分量的相位信息来解析三维取向。与现有的偏振荧光显微成像技术相比，其在解析偶极子三维取向方面有较高的时空分辨率，即实现了高时空分辨率下荧光偶极子三维取向的测量。

图 6. SDOM、pSIM、DMD-3DSIM和3DOM系统示意图^{［18，21，44，60］}。（a）SDOM系统示意图；（b）pSIM系统示意图；（c）DMD-3DSIM系统示意图；（d）3DOM系统示意图

Fig. 6. Schematic diagrams of SDOM, pSIM, and 3DOM systems^{[18,21,44,60]}. (a) Schematic diagram of SDOM system; (b) schematic diagram of pSIM system; (c) schematic diagram of DMD-3DSIM system; (d) schematic diagram of 3DOM system

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3.6　单分子取向定位显微技术

偏振调制同样被广泛应用于单分子定位显微镜（SMLM）中，这些用于单分子二维或三维取向估计的技术可以统称为单分子取向定位显微技术。在标准成像技术中，单个荧光分子的尺寸远小于荧光波长 $λ$ ，因此它们只能被分辨到 $λ / 2$ 的量级范围。图7（a）中，在临界的脉冲照明条件下，荧光分子的激活表现出强烈的随机性^［61］，大量染料分子中只有一个子集被激活，使得单次拍摄时被激发的分子个体间隔足够大，不会在图像上产生重叠。通过多次激发和采集，可以以远高于衍射极限的精度估计每个分子的坐标，如图7（b）所示。在这种单分子定位显微镜的方法被提出后不久，便产生了通过激发光偏振变化激发分子所固有的线性二色性，进行单分子二维取向估计的方法^{［41，62］}。并且由于线性二色性仅具有两个独立参数，因此又产生了引入多个照明角度的方法^{［42，63-64］}，通过添加额外的编码信息来估计三维方向。后来，研究人员注意到，荧光分子的空间坐标以及其三维取向的方向不同时，在一定的成像条件下，会表现出非常不同的散焦图案^［65-67］，如图7（c）所示。这提供了在空间坐标之外同时估计取向参数的途径。需要注意的是，方向估计需要在嘈杂的图像中拟合细微的特征，因此必须仔细校准光学像差，通常需要在线测量特定的样品引起的像差^［43］。

图 7. 单分子显微镜定位与取向参数估计原理。（a）PALM激发过程^［61］；（b）PALM定位原理^［68］；（c）右手球面坐标系与不同取向参数导致的不同衍射花样^［69］

Fig. 7. Principles of localization and orientation parameter estimation for single-molecule microscopy. (a) PALM excitation process^[61]; (b) PALM positioning principle^[68]; (c) different diffraction patterns caused by the right-handed spherical coordinate system and different orientation parameters^[69]

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除了散焦图像之外，也可以通过探测端偏振分裂的方法获取分子取向信息及其动态变化。荧光团发出的光都具有一定的偏振状态，但一般的成像检测器通常对偏振不敏感。为了捕获这些缺失的信息，荧光穿过成像系统到达检测器阵列前，可以将它们分成多个不同的偏振分量，每个偏振分量都被成像到不同的探测器或同一探测器的不同部分^{［40，70-71］}。方向信息被编码在各个分离的光斑相对亮度中，通过测量它们之间的强度比，从而获取有关取向参数的信息。这种方法相较于散焦探测来说，对像差的鲁棒性更强，但是牺牲了一定的信噪比和测量精度。

2023年，Zhang等^［43］开发了结合了偏振探测和光瞳分裂的组合技术，称为径向和方位偏振多视角反射器（raMVR）显微镜，如图8所示，其使用涡旋半波片将方向信息编码，并使用偏振分束镜和特别设计的方形金字塔棱镜共产生8个具有不同花样的成像通道，通过对这8个通道进行算法解调，该显微镜在测量单分子位置和方向的参数时实现了各向同性成像分辨率和~1.5×精度，同时表现出出色的抗像差鲁棒性，成功地对被球体、淀粉样蛋白β低聚物标记的脂质膜进行了单分子精度的六维成像。

图 8. raMVR显微镜相关概念^［43］。（a）raMVR显微镜示意图；（b）raMVR金字塔反射镜；（c）尼罗红分子与二氧化硅球体周围含有40%胆固醇的DPPC SLBs瞬间结合成像，根据测得的角度对线进行定向和颜色编码

Fig. 8. Concept of the raMVR SMOLM^[43]. (a) Schematic of the raMVR microscope; (b) the raMVR pyramidal mirrors; (c) NR molecules transiently binding to DPPC SLBs containing 40% cholesterol surrounding a silica sphere, lines are oriented and colour-coded according to the measured polar angle

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3.7　基于偏振调制的分辨率增强显微技术

上一小节中偏振调制与各种类型显微镜集合的目的在于获取偶极子的取向信息及其动态变化，而偏振作为荧光的另一重要特性，同样可以带来一定程度的空间分辨率提升。线偏振光优先激发与其偏振平行的荧光偶极子，当用旋转线偏振光激发荧光偶极子时，不同方向的荧光偶极子会发出在不同时间达到峰值的周期性信号。这在一定程度上增加了激发和成像的稀疏性，有助于荧光图像最终的分辨率提升，也就是说，可以通过样品结构上荧光染料的不同平均取向来区分样品中的相邻分子或背景区域。根据这一特性，2014年Hafi等^［20］利用宽场显微镜，提出一种基于荧光偏振解调的超分辨显微成像技术（SPoD），如图9（a）所示，该技术通过以固定频率从两个维度旋转 $λ / 2$ 波片改变宽场激发光的偏振态，采用宽场相机探测荧光偶极子的周期性信号，最后利用解调和稀疏惩罚增强估计（SPEED）去卷积算法进行处理。这使得与不同取向分子有效激发相关的偏振角范围缩小，从而让重叠荧光分子有更好的空间分辨率，可以单独分离亚衍射细节，如图9（b）所示。类似地，2018年Zheng等^［22］开发了基于多角度全内反射荧光显微镜（MA-TIRF）偏振扩展的P-TIRF显微技术。传统的MA-TIRF在横向分辨率方面表现不佳，无法表征密集分布区域的深度图像。通过将偏振调制器VHR引入传统扫描MA-TIRF系统的照明路径中，使得扫描光束入射角度、在VHR上的位置、引入的偏振状态同时改变，来实现匹配采集素的快速偏振调制，最终通过稀疏性和加速的近端算法，实现了更精确的3D样品结构重建，如图9（c）所示。在图9（d）中，对微管固定细胞的实验结果进行了评估，证明了P-TIRF在表征横向特征和增强轴向分辨率方面的优势，以各向同性增强分辨率还原了细胞、蛋白等生物样品的三维结构。

偏振扩展荧光显微镜。（a）SPoD系统示意图［20］；（b）衍射限制荧光图像与Richardson‐Lucy去卷积结果、SPoD图像的比较；（c）P-TIRF示意图［22］；（d）固定微管的P-TIRF成像、Ring-TIRF图像、曲线拟合、Boulanger方法和P-TIRF重构深度图的比较

图 9. 偏振扩展荧光显微镜。（a）SPoD系统示意图^［20］；（b）衍射限制荧光图像与Richardson‐Lucy去卷积结果、SPoD图像的比较；（c）P-TIRF示意图^［22］；（d）固定微管的P-TIRF成像、Ring-TIRF图像、曲线拟合、Boulanger方法和P-TIRF重构深度图的比较

Fig. 9. Polarization-expanded fluorescence microscopy. (a) Schematic diagram of SPoD system^[20]; (b) comparison of diffraction-limited fluorescence images with Richardson-Lucy deconvolution results and SPoD images; (c) schematic diagram of P-TIRF^[22]; (d) P-TIRF imaging, Ring TIRF imaging, curve fitting of fixed microtubules, and comparison of Boulanger method and P-TIRF reconstruction depth map

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荧光分子的空间坐标以及其三维取向的方向不同时，在一定的成像条件下，会表现出非常不同的衍射图案。因此，单分子的横向定位准确度和精密度会受到其取向的显著影响。如果善加利用，这种衍射图案对荧光团方向和位置的高度依赖性，可以用来实现更高的空间检测精度^［72-74］。Lew等^［75-76］对偶极辐射导致的分子定位误差进行了模拟，发现偏振成像会一定程度上抑制了偶极子发出的径向偏振光，使得由偶极方向不对称性引起的分子方向和物镜失焦程度的定位误差可以忽略不计。此外，即使在不匹配介质中成像有像差的情况下也能保持定位精度。

4　偏振荧光显微技术的生物医学应用

偏振荧光显微镜以其对荧光分子偶极子取向的强大测量能力，既被生物细胞等领域研究人员广泛应用于巨型囊泡、细胞膜磷脂、细胞质、隔膜蛋白、肌动蛋白和微管等结构分布的探测中，又被新型药物开发人员用于药理学筛选测定以对药物作用方式进行更好的探测和分析。

4.1　膜类结构观测

早期荧光各向异性测量的一个主要目的是获得生物分子的转动特征。1990年，Florine-Casteel^［77］采用落射照明偏振荧光显微镜进一步成像单层囊泡并间接测量得到脂质顺序，利用高数值孔径显微镜在细胞大小的囊泡中以1 μm²的空间分辨率测量脂质顺序。由脂质混合物制成的巨型囊泡被普遍认为是研究脂质相互作用的基本模型^［78-81］，表现出不同流动性、弹性和极性性质的共存状态。与巨型囊泡相比，细胞膜的形态结构更复杂，偏振荧光显微镜对于偶极子取向的成像能力在观察典型细胞细胞膜结构上表现出更明显的效果。羰花青染料常常被用来标记细胞、细胞器、脂质体、病毒和脂蛋白。1979年，Axelord^［56］利用宽场偏振荧光显微镜研究羰花青染料分子（diI）在红细胞膜中的取向，证明了diI共轭桥发色团平行于细胞表面且羰花青染料的酰基链与膜双层磷脂的酰基链平行，并得到染料分子偶极子的取向以及染料分子在膜中绕垂直于膜的轴的旋转速率。1990年，Dix等^［82］利用落射偏振荧光显微镜，通过细胞质探针2，7-双-羧乙基-5（和6）羧基荧光素和indo-1的荧光各向异性图像和其时间分辨荧光衰减，来测量Madin-Darby犬肾细胞和Swiss 3T3成纤维细胞中的细胞质粘度。2013年，Wang等^［32］采用共聚焦偏振荧光显微镜测量被垂直于膜的膜蛋白染料标记的COS-7细胞细胞膜结构，如图10（a）所示，其证明了不太有序的细胞质区域有着更加均匀的响应。

图 10. 一些生物方面的应用。（a）被垂直于膜的膜蛋白染料标记的COS-7细胞；（b）淀粉样蛋白-脂质相互作用；（c）活酵母细胞隔膜蛋白和核孔蛋白的超分辨偶极子成像

Fig. 10. Some biological applications. (a) COS-7 cells labeled with membrane protein dyes perpendicular to the membrane; (b) amyloid-lipid interactions; (c) super-resolution dipole imaging of septins and nucleoporins in live yeast cells

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脂质膜和淀粉样蛋白聚集体之间纳米尺度的相互作用对于研究神经退行性疾病的发病机制具有重大意义^［83-84］。2023年，Zhang等^［43］采用兼具偏振探测和光瞳分解技术的单分子取向定位显微镜对与阿尔茨海默病相关的42残基淀粉样β肽（Aβ42）聚集体进行成像，证明了在脂膜存在的情况下，Aβ42聚集是极其不均匀的，且随着Aβ42聚集反应的延长膜紊乱通常会变得更加不均匀，如图10（b）所示。

4.2　蛋白质类结构观测

隔膜蛋白被认为是第四种细胞骨架^［85］，有着明显的荧光偏振特性。胞质分裂中，沙漏状和环状隔膜蛋白细丝结构形式是存在争议的。2006年，Vrabioiu等^［24］采用宽场偏振荧光显微镜观察被绿色荧光蛋白标记的活酵母隔膜蛋白，证明了其在从沙漏到环的过渡期间，隔膜蛋白细丝在膜平面中旋转90°并变成圆周状，解决了该领域长期存在的争议并为隔膜蛋白在细胞分裂中具有机械功能提供了有力的证据。在此工作基础上，为了确定隔膜蛋白在活细胞中的组织情况，2011年DeMay等^［25］采用一种用于测量高时空分辨率下绿色荧光蛋白偶极矩取向的偏振荧光显微成像系统，证明了在丝状真菌和哺乳动物上皮细胞中隔膜蛋白以相同的高度有序的方式排列。2015年，Abrahamsson等^［29］利用多焦点三维偏振荧光显微镜揭示了芽殖酵母细胞分裂中的蛋白质组装过程。2016年，席鹏课题组^［21］采用超分辨偶极子取向映射方法突破衍射极限的限制，观察到亚衍射范围内隔膜蛋白典型的双环结构，实现活酵母细胞中隔膜蛋白和核孔复合蛋白的超分辨偶极子成像，如图10（c）所示。

肌动蛋白是细胞中微丝和细丝的单体亚基，参与着细胞分裂、胞质分裂和细胞运动等众多重要的细胞生命过程。2012年，Vishwasrao等^［39］在双光子荧光各向异性成像基础上，研发了一种利用共振能量转移^［86］肌动蛋白聚合状态成像方法。该方法表明肌动蛋白-GFP荧光各向异性和肌动蛋白聚合物分数之间的简单关系，并能够以高时空分辨率对肌动蛋白聚合状态进行成像。此外，2016年席鹏课题组^［21］还将超分辨偶极子映射方法运用在固定哺乳动物细胞中肌动蛋白上，实现其超分辨偶极子取向测量。2018年，Markwardt等^［33］利用倒置偏振光片荧光显微镜跟踪线虫胚胎发育过程中肌球蛋白磷酸化的变化，研究发现调节轻链磷酸化动态的过程与蛋白质表达的变化是相互独立的。了解肌动蛋白丝取向的细胞内分布对于解释肌动蛋白细胞骨架系统驱动的细胞运动至关重要^［87］。2023年，席鹏课题组^［44］利用3DOM技术实现对肌动蛋白丝分子结构的精确测量，进一步支持肌动蛋白丝可以形成具有集体取向的线性结构观点，并且该现象可能与细胞中的机械应力有关。

微管主要存在于细胞质中，一般呈网状或者束状分布，表现为动态结构特征，在维持细胞形态结构、细胞运动等方面发挥着重要的作用。2023年，席鹏课题组^［44］采用3DOM技术对活U2OS细胞中的微管进行动态成像，发现绿色荧光蛋白偶极子取向不平行或不垂直现象，打破了之前微管中心对称的看法。研究表明，微管及其相关运动蛋白与肌动蛋白和肌球蛋白协同作用，促进膜管化。

4.3　其他生物医学应用

此外，荧光偏振还可以用于药理学筛选测定，以测量药物-蛋白质或蛋白质-蛋白质的相互作用。该技术采用荧光标记药物通过荧光偏振成像测量体内药物靶点的参与情况，对于药理学新型药物开发有着重要的指导意义。

Dubach等^{［46，88］}使用多光子荧光各向异性显微镜获取不同分子相互作用的定量药理学结合信息，实现细胞和亚细胞尺度下活体实时体内药物分布和相互作用的测量。2014年，Dubach等^［46］首次实现靶标结合与未结合的小分子药物的实时可视化。他们在Ⅲ期临床试验中使用化疗化合物并证明该方法不仅适用于培养的活细胞，而且还能够以亚微米分辨率对体内药物靶标进行实时成像。2016年，Vinegoni等^［88］开发了双光子FA显微镜来测量体内药物分布。该成像技术能够实现高时空分辨率成像，同时定量区分结合态和非结合态，并已经在Ⅲ期候选药物中证明，其在体外和小鼠肿瘤体内情况下都具有亚微米分辨率和深穿透。

5　总结与展望

与通常的荧光显微技术注重荧光分子的位置和浓度信息不同，偏振荧光显微技术能够额外地获取生物分子的结构取向，已被广泛应用于单分子结构、蛋白质结构和生物细胞膜结构的研究。而在日趋复杂的生物医学应用场景中解码分子结构和功能，需要不断提高偏振荧光显微成像工具的性能。因此偏振荧光显微成像技术由最初基于荧光各向异性原理到利用线性二向色性特性测定偶极子取向信息及其动态变化，再到基于空间-角度偶极子成像理论实现对分子空间位置和角度取向的更精确解析，其理论和技术方法一直在不断迭代、更新和融合。荧光的偏振特性及其特异性标记生物分子的能力是偏振荧光显微技术实现间接测量生物细胞器和生物大分子取向信息及其动态变化的基础，该原理的应用可以推广到同样具有偏振特性的类荧光或非荧光成像中^{［45，89-90］}，比如二次谐波成像^［91-93］、表面增强拉曼散射^［94］、穆勒矩阵成像^［95-96］等。

当然现有的偏振荧光显微技术也存在一定的局限性。首先，分子结构的取向是空间三维的，大多数基于二维平面的分子取向观测都难免存在一定的偏差。虽然通过单分子取向成像^［43］和光片显微成像^［33-35］已经在分子三维取向成像方面取得了一些成功，但是全面的分子三维取向观测，仍然需要更加优化的偏振调制设计，以及成像模型和图像重构的理论创新。其次，当前分子方向的重构往往基于一定时间内的信号平均或多次测量的反演，导致其时间分辨率受限，难以对动态的分子指向进行观测，如何实现高时间分辨率的分子指向成像也是当前面临的一个很大挑战。最后，荧光偏振显微成像依赖于极化的荧光探针与靶向生物分子的稳定标记，进而通过荧光分子取向揭示生物结构取向。目前符合条件的可选荧光探针仍然不是很多，研制适于偏振调制的荧光探针也是未来偏振荧光显微技术领域重要的发展方向。

参考文献

[1] Lichtman J W, Conchello J A. Fluorescence microscopy[J]. Nature Methods, 2005, 2(12): 910-919.

[2] KubitscheckU. Fluorescence microscopy: from principles to biological applications[M]. 2nd ed. Singapore: John Wiley & Sons Inc, 2017.

[3] LakowiczJ R. Principles of fluorescence spectroscopy[M]. 3rd ed. Boston: Springer US, 2006.

[4] Huang B, Bates M, Zhuang X W. Super-resolution fluorescence microscopy[J]. Annual Review of Biochemistry, 2009, 78: 993-1016.

[5] Sahl S J, Hell S W, Jakobs S. Fluorescence nanoscopy in cell biology[J]. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, 2017, 18(11): 685-701.

[6] Reinhardt S C M, Masullo L A, Baudrexel I, et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy[J]. Nature, 2023, 617(7962): 711-716.

[7] Haraguchi T, Shimi T, Koujin T, et al. Spectral imaging fluorescence microscopy[J]. Genes to Cells, 2002, 7(9): 881-887.

[8] Jahr W, Schmid B, Schmied C, et al. Hyperspectral light sheet microscopy[J]. Nature Communications, 2015, 6: 7990.

[9] Datta R, Heaster T M, Sharick J T, et al. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications[J]. Journal of Biomedical Optics, 2020, 25(7): 071203.

[10] Levchenko S M, Pliss A, Qu J L. Fluorescence lifetime imaging of fluorescent proteins as an effective quantitative tool for noninvasive study of intracellular processes[J]. Journal of Innovative Optical Health Sciences, 2018, 11(1): 1730009.

[11] AxelrodD. Fluorescence polarization microscopy[M]∥Methods in cell biology. Amsterdam: Elsevier, 1989, 30: 333-352.

[12] 许志兵, 周文霞, 徐东东, 等. 荧光偏振调制显微成像技术研究进展[J]. 激光与光电子学进展, 2021, 58(24): 2400006.

Xu Z B, Zhou W X, Xu D D, et al. Research progress of fluorescence polarization modulation microscopy imaging technology[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2021, 58(24): 2400006.

[13] Brasselet S, Alonso M A. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging to single-molecule 3D orientation and localization microscopy[J]. Optica, 2023, 10(11): 1486-1510.

[14] Chandler T, Shroff H, Oldenbourg R, et al. Spatio-angular fluorescence microscopy I. Basic theory[J]. Journal of the Optical Society of America A, 2019, 36(8): 1334-1345.

[15] Chandler T, Shroff H, Oldenbourg R, et al. Spatio-angular fluorescence microscopy II. Paraxial 4f imaging[J]. Journal of the Optical Society of America A, 2019, 36(8): 1346-1360.

[16] Chandler T, Shroff H, Oldenbourg R, et al. Spatio-angular fluorescence microscopy III. Constrained angular diffusion, polarized excitation, and high-NA imaging[J]. Journal of the Optical Society of America A, 2020, 37(9): 1465-1479.

[17] Mehta S B, McQuilken M, La Riviere P J, et al. Dissection of molecular assembly dynamics by tracking orientation and position of single molecules in live cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(42): E6352-E6361.

[18] Zhanghao K, Chen X Y, Liu W H, et al. Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 4694.

[19] McQuilken M, Jentzsch M S, Verma A, et al. Analysis of septin reorganization at cytokinesis using polarized fluorescence microscopy[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2017, 5: 42.

[20] Hafi N, Grunwald M, van den Heuvel L S, et al. Fluorescence nanoscopy by polarization modulation and polarization angle narrowing[J]. Nature Methods, 2014, 11(5): 579-584.

[21] Zhanghao K, Chen L, Yang X S, et al. Super-resolution dipole orientation mapping via polarization demodulation[J]. Light, Science & Applications, 2016, 5(10): e16166.

[22] Zheng C, Zhao G Y, Liu W J, et al. Three-dimensional super-resolved live cell imaging through polarized multi-angle TIRF[J]. Optics Letters, 2018, 43(7): 1423-1426.

[23] Inoue S, Shimomura O, Goda M, et al. Fluorescence polarization of green fluorescence protein[J]. The Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(7): 4272-4277.

[24] Vrabioiu A M, Mitchison T J. Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy[J]. Nature, 2006, 443(7110): 466-469.

[25] DeMay B S, Bai X B, Howard L, et al. Septin filaments exhibit a dynamic, paired organization that is conserved from yeast to mammals[J]. The Journal of Cell Biology, 2011, 193(6): 1065-1081.

[26] Forkey J N, Quinlan M E, Goldman Y E. Protein structural dynamics by single-molecule fluorescence polarization[J]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2000, 74(1/2): 1-35.

[27] Zhang O M, Lew M D. Single-molecule orientation localization microscopy I: fundamental limits[J]. Journal of the Optical Society of America A, 2021, 38(2): 277-287.

[28] Zhang O M, Lew M D. Single-molecule orientation localization microscopy II: a performance comparison[J]. Journal of the Optical Society of America A, 2021, 38(2): 288-297.

[29] Abrahamsson S, McQuilken M, Mehta S B, et al. MultiFocus Polarization Microscope (MF-PolScope) for 3D polarization imaging of up to 25 focal planes simultaneously[J]. Optics Express, 2015, 23(6): 7734-7754.

[30] Bigelow C E, Conover D L, Foster T H. Confocal fluorescence spectroscopy and anisotropy imaging system[J]. Optics Letters, 2003, 28(9): 695-697.

[31] Kress A, Wang X, Ranchon H, et al. Mapping the local organization of cell membranes using excitation-polarization-resolved confocal fluorescence microscopy[J]. Biophysical Journal, 2013, 105(1): 127-136.

[32] Wang X, Kress A, Brasselet S, et al. High frame-rate fluorescence confocal angle-resolved linear dichroism microscopy[J]. The Review of Scientific Instruments, 2013, 84(5): 053708.

[33] Markwardt M L, Snell N E, Guo M, et al. A genetically encoded biosensor strategy for quantifying non-muscle myosin II phosphorylation dynamics in living cells and organisms[J]. Cell Reports, 2018, 24(4): 1060-1070.

[34] ChandlerT, GuoM, MehtaS, et al. Three-dimensional fluorophore orientation imaging with multiview polarized microscopy[C]∥Imaging and Applied Optics 2018 (3D, AO, AIO, COSI, DH, IS, LACSEA, LS&C, MATH, pcAOP), June 25-28, 2018, Orlando, Florida. Washington, DC: OSA, 2018: MW3D.2.

[35] ChandlerT. Spatio-angular fluorescence microscopy[D]. Chicago: The University of Chicago, 2020.

[36] Li W, Wang Y, Shao H R, et al. Probing rotation dynamics of biomolecules using polarization based fluorescence microscopy[J]. Microscopy Research and Technique, 2007, 70(4): 390-395.

[37] Gasecka A, Han T J, Favard C, et al. Quantitative imaging of molecular order in lipid membranes using two-photon fluorescence polarimetry[J]. Biophysical Journal, 2009, 97(10): 2854-2862.

[38] Lazar J, Bondar A, Timr S, et al. Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function[J]. Nature Methods, 2011, 8(8): 684-690.

[39] Vishwasrao H D, Trifilieff P, Kandel E R. In vivo imaging of the actin polymerization state with two-photon fluorescence anisotropy[J]. Biophysical Journal, 2012, 102(5): 1204-1214.

[40] Gould T J, Gunewardene M S, Gudheti M V, et al. Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies[J]. Nature Methods, 2008, 5(12): 1027-1030.

[41] Ha T, Enderle T, Chemla S, et al. Single molecule dynamics studied by polarization modulation[J]. Physical Review Letters, 1996, 77(19): 3979-3982.

[42] Pfennig D, Albrecht A, Nowak J, et al. A device for exploring the full angular excitation space-Can more angular projections improve determination of a molecules 3D-orientation in the presence of noise?[J]. Chemical Physics, 2020, 538: 110853.

[43] Zhang O M, Guo Z J, He Y Y, et al. Six-dimensional single-molecule imaging with isotropic resolution using a multi-view reflector microscope[J]. Nature Photonics, 2023, 17(2): 179-186.

[44] ZhongS, QiaoL, GeX, et al. Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution using polarization modulation[EB/OL]. [2023-11-09]. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.12.571225v1.

[45] Koike-Tani M, Tani T, Mehta S B, et al. Polarized light microscopy in reproductive and developmental biology[J]. Molecular Reproduction and Development, 2015, 82(7/8): 548-562.

[46] Dubach J M, Vinegoni C, Mazitschek R, et al. In vivo imaging of specific drug-target binding at subcellular resolution[J]. Nature Communications, 2014, 5: 3946.

[47] Borejdo J, Burlacu S. Orientation of actin filaments during motion in in vitro motility assay[J]. Biophysical Journal, 1994, 66(5): 1319-1327.

[48] Pollok B A, Heim R. Using GFP in FRET-based applications[J]. Trends in Cell Biology, 1999, 9(2): 57-60.

[49] Truong K, Ikura M. The use of FRET imaging microscopy to detect protein–protein interactions and protein conformational changes in vivo[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2001, 11(5): 573-578.

[50] Sekar R B, Periasamy A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations[J]. The Journal of Cell Biology, 2003, 160(5): 629-633.

[51] Silvius J R, Nabi I R. Fluorescence-quenching and resonance energy transfer studies of lipid microdomains in model and biological membranes[J]. Molecular Membrane Biology, 2006, 23(1): 5-16.

[52] NiQ, ZhangJ. Dynamic visualization of cellular signaling[M]∥EndoI, NagamuneT. Nano/micro biotechnology. Advances in biochemical engineering/biotechnology. Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2009, 119: 79-97.

[53] Zhanghao K, Gao J T, Jin D Y, et al. Super-resolution fluorescence polarization microscopy[J]. Journal of Innovative Optical Health Sciences, 2018, 11(1): 1730002.

[54] Mattheyses A L, Kampmann M, Atkinson C E, et al. Fluorescence anisotropy reveals order and disorder of protein domains in the nuclear pore complex[J]. Biophysical Journal, 2010, 99(6): 1706-1717.

[55] Burghardt T P. Model-Independent fluorescence polarization for measuring order in a biological assembly[J]. Biopolymers, 1984, 23(11): 2383-2406.

[56] Axelrod D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization[J]. Biophysical Journal, 1979, 26(3): 557-573.

[57] Dale R E, Hopkins S C, an der Heide U A, et al. Model-independent analysis of the orientation of fluorescent probes with restricted mobility in muscle fibers[J]. Biophysical Journal, 1999, 76(3): 1606-1618.

[58] 刘华锋, 郭敏, 刘钧宇. 基于广义理查德森-露西算法的荧光分子空间和角度分布重建方法: CN115953319A[P]. 2023-04-11. 10.1118/1.4917082

LiuH F, GuoM, LiuJ Y. Reconstruction method of spatial and angular distribution of fluorescent molecules based on the generalized Richardson Lucy algorithm: CN115953319A[P]. 2023-04-11.

[59] Ferrand P, Gasecka P, Kress A, et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores[J]. Biophysical Journal, 2014, 106(11): 2330-2339.

[60] Li Y N, Cao R J, Ren W, et al. High-speed autopolarization synchronization modulation three-dimensional structured illumination microscopy[J]. Advanced Photonics Nexus, 2023, 3(1): 016001.

[61] Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution[J]. Science, 2006, 313(5793): 1642-1645.

[62] Schütz G J, Schindler H, Schmidt T. Imaging single-molecule dichroism[J]. Optics Letters, 1997, 22(9): 651-653.

[63] Olveczky B P, Periasamy N, Verkman A S. Mapping fluorophore distributions in three dimensions by quantitative multiple angle-total internal reflection fluorescence microscopy[J]. Biophysical Journal, 1997, 73(5): 2836-2847.

[64] Forkey J N, Quinlan M E, Goldman Y E. Measurement of single macromolecule orientation by total internal reflection fluorescence polarization microscopy[J]. Biophysical Journal, 2005, 89(2): 1261-1271.

[65] Dickson R M, Norris D J, Moerner W E. Simultaneous imaging of individual molecules aligned both parallel and perpendicular to the optic axis[J]. Physical Review Letters, 1998, 81(24): 5322-5325.

[66] Böhmer M, Enderlein J. Orientation imaging of single molecules by wide-field epifluorescence microscopy[J]. Journal of the Optical Society of America B, 2003, 20(3): 554-559.

[67] Patra D, Gregor I, Enderlein J. Image analysis of defocused single-molecule images for three-dimensional molecule orientation studies[J]. The Journal of Physical Chemistry A, 2004, 108(33): 6836-6841.

[68] Sauer M, Heilemann M. Single-molecule localization microscopy in eukaryotes[J]. Chemical Reviews, 2017, 117(11): 7478-7509.

[69] Toprak E, Enderlein J, Syed S, et al. Defocused orientation and position imaging (DOPI) of myosin V[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(17): 6495-6499.

[70] Ohmachi M, Komori Y, Iwane A H, et al. Fluorescence microscopy for simultaneous observation of 3D orientation and movement and its application to quantum rod-tagged myosin V[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(14): 5294-5298.

[71] Rimoli C V, Valades-Cruz C A, Curcio V, et al. 4polar-STORM polarized super-resolution imaging of actin filament organization in cells[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 301.

[72] Engelhardt J, Keller J, Hoyer P, et al. Molecular orientation affects localization accuracy in superresolution far-field fluorescence microscopy[J]. Nano Letters, 2011, 11(1): 209-213.

[73] Backlund M P, Lew M D, Backer A S, et al. Simultaneous, accurate measurement of the 3D position and orientation of single molecules[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(47): 19087-19092.

[74] Backlund M P, Arbabi A, Petrov P N, et al. Removing orientation-induced localization biases in single-molecule microscopy using a broadband metasurface mask[J]. Nature Photonics, 2016, 10: 459-462.

[75] Lew M D, Backlund M P, Moerner W E. Rotational mobility of single molecules affects localization accuracy in super-resolution fluorescence microscopy[J]. Nano Letters, 2013, 13(9): 3967-3972.

[76] Lew M D, Moerner W E. Azimuthal polarization filtering for accurate, precise, and robust single-molecule localization microscopy[J]. Nano Letters, 2014, 14(11): 6407-6413.

[77] Florine-Casteel K. Phospholipid order in gel- and fluid-phase cell-size liposomes measured by digitized video fluorescence polarization microscopy[J]. Biophysical Journal, 1990, 57(6): 1199-1215.

[78] Dietrich C, Bagatolli L A, Volovyk Z N, et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes[J]. Biophysical Journal, 2001, 80(3): 1417-1428.

[79] Samsonov A V, Mihalyov I, Cohen F S. Characterization of cholesterol-sphingomyelin domains and their dynamics in bilayer membranes[J]. Biophysical Journal, 2001, 81(3): 1486-1500.

[80] Scherfeld D, Kahya N, Schwille P. Lipid dynamics and domain formation in model membranes composed of ternary mixtures of unsaturated and saturated phosphatidylcholines and cholesterol[J]. Biophysical Journal, 2003, 85(6): 3758-3768.

[81] Baumgart T, Hess S T, Webb W W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension[J]. Nature, 2003, 425(6960): 821-824.

[82] Dix J A, Verkman A S. Mapping of fluorescence anisotropy in living cells by ratio imaging. Application to cytoplasmic viscosity[J]. Biophysical Journal, 1990, 57(2): 231-240.

[83] Haass C, Selkoe D J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide[J]. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, 2007, 8(2): 101-112.

[84] Iadanza M G, Jackson M P, Hewitt E W, et al. A new era for understanding amyloid structures and disease[J]. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, 2018, 19(12): 755-773.

[85] Mostowy S, Cossart P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton[J]. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, 2012, 13(3): 183-194.

[86] Clayton A H A, Hanley Q S, Arndt-Jovin D J, et al. Dynamic fluorescence anisotropy imaging microscopy in the frequency domain (rFLIM)[J]. Biophysical Journal, 2002, 83(3): 1631-1649.

[87] Xu K, Babcock H P, Zhuang X W. Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actin cytoskeleton[J]. Nature Methods, 2012, 9(2): 185-188.

[88] Vinegoni C, Dubach J M, Feruglio P F, et al. Two-photon fluorescence anisotropy microscopy for imaging and direct measurement of intracellular drug target engagement[J]. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 2016, 22(3): 6801607.

[89] Brasselet S. Polarization-resolved nonlinear microscopy: application to structural molecular and biological imaging[J]. Advances in Optics and Photonics, 2011, 3(3): 205.

[90] He C, He H H, Chang J T, et al. Polarisation optics for biomedical and clinical applications: a review[J]. Light, Science & Applications, 2021, 10(1): 194.

[91] Gusachenko I, Tran V, Houssen Y G, et al. Polarization-resolved second-harmonic generation in tendon upon mechanical stretching[J]. Biophysical Journal, 2012, 102(9): 2220-2229.

[92] Tilbury K, Lien C H, Chen S J, et al. Differentiation of col I and col III isoforms in stromal models of ovarian cancer by analysis of second harmonic generation polarization and emission directionality[J]. Biophysical Journal, 2014, 106(2): 354-365.

[93] Rouède D, Schaub E, Bellanger J J, et al. Wavy nature of collagen fibrils deduced from the dispersion of their second-order nonlinear optical anisotropy parameters Ρ[J]. Optics Express, 2020, 28(4): 4845-4858.

[94] Wang M Y, Chen M, Zhanghao K, et al. Polarization-based super-resolution imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with orientational information[J]. Nanoscale, 2018, 10(42): 19757-19765.

[95] He C, Chang J T, Salter P S, et al. Revealing complex optical phenomena through vectorial metrics[J]. Advanced Photonics, 2022, 4(2): 026001.

[96] 王晔, 何宏辉, 曾楠, 等. 基于穆勒矩阵的偏振显微镜及其在生物医学领域的应用[J]. 世界复合医学, 2015, 1(1): 74-78.

Wang Y, HeH H, Zeng N, et al. Polarized light microscopy based on Mueller matrix and its applications on biomedical studies[J]. World Journal of Complex Medicine, 2015, 1(1): 74-78.

魏明哲, 刘钧宇, 郭敏, 刘华锋. 偏振荧光显微成像技术及研究进展（特邀）[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(6): 0618011. Mingzhe Wei, Junyu Liu, Min Guo, Huafeng Liu. Polarized Fluorescence Microscopy and Recent Progress (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618011.