流感病毒是呼吸道传染病毒, 增强疫苗接种诱导的黏膜免疫反应对于预防流感尤为重要。目前, 流感病毒疫苗主要为病毒灭活疫苗, 且通过肌肉注射接种, 很难诱导产生黏膜免疫。为增强流感病毒灭活疫苗的黏膜免疫效果, 本文利用薄膜分散法将与肺表面活性物质(PS)相似的磷脂以及胆固醇制备成包裹瑞喹莫德(R848)的PS脂质体(PS-R848)做黏膜佐剂, 将该脂质体与H7N9流感病毒灭活疫苗混合后经鼻腔免疫BALB/c雌性小鼠, 检测免疫指标及攻毒后的保护效果。与灭活疫苗添加R848组相比, 血清中的免疫球蛋白G(IgG)以及分型抗体IgG1与IgG2a效价、血凝抑制(HI)效价和支气管肺泡灌洗液分泌型IgA(sIgA)效价显著提高; 诱导的细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)与IL-4的分泌量也显著增加。用同亚型流感病毒攻毒小鼠后的肺部病毒滴度较单独疫苗组降低, 存活率达到100%, 最大体重丢失率较单独疫苗组低且有显著差异 。以上结果表明, R848仿生PS-R848作为黏膜佐剂可以有效提高H7N9流感病毒灭活疫苗的免疫效果, 为开发流感病毒的黏膜疫苗做了数据积累。

流感病毒灭活疫苗通常需要添加佐剂来增强其免疫保护效果。铝佐剂是常用的人用疫苗佐剂, 主要诱导Th2型免疫应答。在本研究中, 我们将氢氧化铝(Al)佐剂与TLR7/8激动剂R848组成复合佐剂, 与流感病毒H7N9灭活疫苗共同免疫小鼠; 单次免疫3周后, 用致死剂量(20 LD50)的同源病毒攻击小鼠。结果显示, 与含单一R848或Al佐剂的疫苗相比较, 添加了R848 + Al复合佐剂的疫苗更能提升小鼠的血清特异性IgG抗体和IgG2a抗体亚类的滴度, 诱导Th1和Th2型细胞因子分泌及Th1偏向的免疫应答, 能为小鼠抗致死量病毒攻击提供更有效的免疫保护。因此, R848+Al复合佐剂系统强于单一的R848或Al 佐剂。本研究对于改良Al佐剂及提高流感灭活疫苗免疫效果具有参考价值。

选用甲型流感H3N2亚型的代表株作为研究对象, 基于对H3蛋白二级结构的分析预测和密码子使用频率曲线, 对其基因序列进行了科学的密码子优化设计。以密码子优化的力度与局部二级结构混乱度成反比为原则, 兼顾表达效率和正确的结构与功能, 将优化后的H3序列克隆至表达载体pPICZα, 电转入毕赤酵母系统中。经甲醇诱导使H3蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达, 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定其表达, 同时筛选高拷贝菌株。最后对该菌株培养发酵, 30℃甲醇诱导72 h后收集发酵的上清液, 采用10?kD膜包过滤对其浓缩, 经钴柱亲和层析等手段得到了H3蛋白的单一条带, 并通过Western blot确认。纯化获得的H3抗原溶液本身不表现出血凝活性, 但是与镍柱填料结合富集后表现出一定程度的血凝活性。本研究为流感病毒H3抗原在毕赤酵母系统中的重组表达和后续疫苗研发提供了基础。

茶中多酚类化合物主要成分儿茶素及其衍生物被发现具有较强的抗病毒作用, 对多种病毒特别是流感病毒有较强的抑制作用, 被认为是一种潜在的抗病毒药物前体。研究发现儿茶素及其衍生物可能成为抗流感病毒药物设计研究中优先考虑的化合物。本文对近二十年来国内外儿茶素及其衍生物等的抗流感病毒作用、作用机制、临床研究以及应用开发等方面进行了综述与分析, 为茶中多酚类化合物抗流感病毒的进一步研究提供参考。

H1N1流感病毒属于常见的致病性病毒。流行病学调查研究表明, 新生儿表型缺陷与流感病毒感染有关, 但是具体机制还不明确。为了探讨H1N1流感病毒对胚胎发育的影响, 本文通过流感病毒感染孕母鼠来构建流感病毒宫内感染的动物模型, 分别在胚胎发育至E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5 d以及出生1 d后测量各胚胎的体长, 并在体视镜下观察胚胎体表各血管和器官来分析胚胎外表发育的情况, 然后采用阿尔新蓝-茜素红染色法观察各发育时期胚胎骨骼发育的情况。结果表明, 流感病毒感染的小鼠胚胎的体长明显降低。外部器官发育的差异性可体现在眼、耳等器官, 攻毒组成型稍晚, 尾部异常卷曲更为严重。各骨骼发育攻毒组较对照组更迟缓, 但没有出现长短肢或骨骼缺失等严重异常表型。本研究首次构建了流感病毒宫内感染的动物模型, 探究了H1N1流感病毒对小鼠胚胎表型发育的影响。

为增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果, 本文构建了含有流感病毒NP的5个重复优势T表位或B表位(包括B1线性表位和B2构象表位)的表达质粒(简称NPT和NPB), 以小鼠为动物模型, 将NPT和NPB分别与H7N9流感病毒HA DNA混合免疫BALB/c小鼠1次, 21 d后用致死剂量(20 LD50)的H7N9流感病毒攻击小鼠。通过检测免疫后小鼠血清特异性抗体滴度和攻毒后的免疫保护性指标-存活率、肺部残余病毒滴度及体重丢失率, 评价表位质粒与HA DNA疫苗混合免疫对小鼠的保护效果。试验结果表明:用致死性H7N9流感病毒攻击小鼠后, HA DNA组小鼠全部死亡,HA+NPT免疫组小鼠存活率达到100%,HA+NPB1和HA+NPB2免疫组, 小鼠存活率分别为30%和75%;混合免疫HA+NPT后小鼠抗体滴度升高明显, 攻毒后小鼠体重丢失明显降低。综上表明, 含有5个NP优势T表位或B表位的表达质粒能增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果, 混合免疫一次可以使小鼠得到较好的保护。HA DNA和表位疫苗的混合免疫, 节约了疫苗用量, 降低了免疫成本, 为流感病毒核酸疫苗的临床开发提供了一定的试验基础。

以BALB/c小鼠为模型, 探讨H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠后所诱导的长效体液免疫应答的动态变化。不同剂量的流感H7N9全病毒灭活疫苗单独或辅以MF59佐剂肌肉注射免疫小鼠一次。连续采集免疫后小鼠15个月的血清, 用ELISA方法检测特异性IgG抗体水平, 血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)试验和微量中和(microneutralization, MN)试验检测第15个月时的HI抗体和中和抗体效价。实验结果发现, 小鼠血清中的特异性IgG抗体水平随时间变化持续缓慢上升, 第5个月时达到顶峰, 随后略有下降但一直持续平稳状态; IgG抗体滴度与疫苗剂量成正相关, 且添加佐剂能提高抗体滴度。HI及MN抗体检测表明, 免疫后第15个月产生的抗体能有效中和病毒, 且抗体跟疫苗剂量成正比。以上研究表明, H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠一次诱导产生的特异性抗体能在较长期内保持比较平稳的抗体滴度, 为小鼠提供免疫保护; 增加抗原剂量和添加MF59佐剂能增加疫苗特异性抗体水平。该研究为H7N9流感疫苗产生的长期保护效应提供了一定的数据积累和参考。

探讨玉竹多糖(Polygonatum odoratun polysaccharides, POP)对流感病毒裂解疫苗黏膜免疫的佐剂效果。以BALB/c小鼠为模型, 将H7N9流感病毒裂解疫苗单独或者添加不同剂量的POP(400、600、800、1 000和1 200 μg)做佐剂一次性滴鼻免疫小鼠, 免疫三周后小鼠以致死剂量同源病毒攻击。实验结果表明, 当在疫苗中加入1 000 μg POP时, 与疫苗单独免疫相比, 单次滴鼻免疫就明显增强了小鼠抵抗致死量病毒感染的能力, 体重丢失减少, 肺部残余病毒滴度下降, 存活率提高; 血清中疫苗特异性IgG抗体和HI抗体以及鼻洗液中SIgA抗体都提高了; IgG亚类抗体检测显示, POP的加入显著增加了IgG1的抗体滴度, 但抑制了IgG2a的产生, 说明诱导的免疫应答偏向于Th2型。实验表明POP在一定剂量时能增强疫苗诱导的免疫应答, 显示出黏膜佐剂效应。

探讨枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)对不同剂量甲型H1N1流感裂解疫苗黏膜免疫的佐剂效力。设单独免疫LBP组和不免疫组作为对照, BALB/c小鼠以滴鼻方式免疫两次, 间隔三周, 二次免疫后两周收集小鼠血清、鼻洗液和脾脏淋巴细胞。结果显示血清中甲流特异性IgG和HI抗体滴度与接种疫苗剂量呈正相关, LBP的添加可提高体内抗体水平。高剂量组小鼠鼻洗液中也检测到特殊异性sIgA。单独疫苗组和添加佐剂组均能在体内诱导产生IgG1和IgG2a, 所有组别IgG1抗体水平均略高于IgG2a, 表明滴鼻接种裂解疫苗诱导Th1/Th2混合型免疫, LBP对Th1和Th2型免疫反应均有增强作用。高剂量疫苗添加LBP佐剂组小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ水平显著高于其他组别, 表明其在小鼠体内诱导了较强烈的细胞免疫反应。以上实验结果均证实LBP可以作为佐剂增强甲流裂解疫苗经黏膜途径免疫时的免疫效力。

在流感灭活疫苗中添加佐剂可以提高疫苗的免疫原性, 节约抗原用量。一些天然中草药多糖具有潜在的佐剂效应。本文探讨了人参多糖(ginseng polysaccharide, GPS)在新甲型H1N1流感病毒裂解型灭活疫苗中的佐剂效应。将不同剂量GPS与新甲型H1N1流感病毒灭活疫苗混合, 共同免疫小鼠一次, 通过检测免疫后在小鼠体内诱导产生的疫苗特异性IgM、IgG、IgG1和IgG2a抗体情况来评价GPS作为流感病毒灭活疫苗佐剂的免疫增强效果, 并与不添加佐剂的疫苗和加有铝佐剂的疫苗的免疫效果作比较。结果显示, GPS与铝佐剂一样能显著提高和维持疫苗特异性IgG抗体滴度, 同时提高IgM抗体水平, 其中800 μg GPS的佐剂效果最好。因此我们认为GPS可以作为流感病毒灭活疫苗的一种候选佐剂。