采用二维荧光相关光谱技术有效地对严重重叠的蒽、芘混合溶液的荧光峰进行解析。为了实现上述研究目标,设计并配置了9个蒽、芘混合溶液。采集了蒽、芘单组份以及两种物质混合溶液的常规一维荧光谱,研究了其荧光特性,并进行对比、分析。在此基础上,以混合溶液中蒽和芘的浓度为外扰,构建二维荧光相关同步谱和异步谱。结果表明:在同步谱上出现6个较强的自相关峰,位置分别在373 nm、379 nm、391 nm、401 nm、413 nm和425 nm处;依据未被覆盖的蒽在425 nm的处荧光与各波长处荧光交叉峰的正负,指出379 nm、401 nm和452 nm处的荧光峰来自蒽,而373 nm、391 nm和413 nm处的荧光峰来自芘。同时,又根据相关异步谱交叉峰的有无,进一步确认和验证了混合溶液中各荧光峰的来源。该方法为解析农业环境中多种污染物的光谱特征提供理论和实验基础。

细胞核浆粘滞系数直接反映一定生理状态下核内微环境的特性,是判断病变细胞和研究核内分子功能机制的重要依据。为了实时、灵敏和无损地测定单个活细胞的核浆粘滞系数,提出了一种基于荧光相关谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)技术的新型检测方法。研究中利用FCS技术测定绿荧光蛋白分子(EGFP)在细胞核内的扩散系数,并且根据Stokes-Einstein关系式计算出核浆粘滞系数,同时实现了对特定生理条件下核浆粘滞系数的跟踪测量。结果表明:在pH 7.4以及37 ℃的条件下,人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)和人宫颈癌细胞(HeLa)的核浆粘滞系数分别是(2.55±0.61)cP和(2.04±0.49)cP,与传统方法的测量结果一致,并且发现核浆粘滞系数大于细胞质的粘滞系数。以上研究表明FCS技术可精确无损地检测单个活细胞内达飞升量级的微观环境,是探索细胞内生物分子动态行为的有力工具。

荧光相关谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是对处于热平衡态条件下的荧光分子发出的荧光强度涨落进行时间相关处理的一种单分子检测方法,能够直接测量分子在溶液里的扩散系数和浓度.影响FCS测量扩散系数准确性的因素有分子量子效率,测量时间,样本折射率和温度偏差等.用FCS分别测量溶有荧光染料罗丹明6G(rhodamine 6G,Rh.6G)和青色素Cy5甘油水溶液的粘滞系数,实验结果表明:荧光分子的量子效率是影响测量准确性的重要因素,要求其每秒发射的光子数目(photon counts per second,cps)至少达到1 000(photons/s).

基于对处于平衡态少量荧光分子集合的强度涨落进行时间平均的技术,荧光相关谱(fluorescencecorrelationspectroscopy,FCS)技术最近已经应用于细胞环境过程的研究.FCS优秀的灵敏特性为我们实时测量许多参数提供了途径,而且具有快速的时间特性和高空间分辨率.测量的参数包括扩散速率、局部浓度、聚合状态和分子间的相互作用.荧光互相关谱(fluorescencecross-correlationspectroscopy,FCCS)进一步扩展了FCS技术的应用,包括在活细胞中的广泛应用.本文介绍了FCS技术的原理、实验装置及其应用.

本文利用多光子激发激光扫描显微镜的部分光路和探测器,建立了双光子荧光相关谱系统(Two-Photon Fluorescence Correlation Spectroscopy,简称TP-FCS).利用TP-FCS系统观察到了"光子爆发"现象,实现了染料分子的双光子激发,测量出若丹明B染料分子在蔗糖溶液中的扩散系数.实验证明该系统具有操作简便、可靠性高、费用低廉等特点,可实现单分子检测.