基于Ce6和MMP-2抑制剂的多级控释脂质纳米复合体用于光动力-免疫协同治疗黑色素瘤 下载: 635次
Melanoma is one of the most immunogenic solid tumors, with strong metastatic characteristics. Although melanoma is curable when detected in a localized form, the long-term survival rates of patients are difficult to improve by any single therapy. The combination of photodynamic therapy (PDT) and immunotherapy has shown encouraging therapeutic efficacy against various cancers due to PDT-induced immunogenic cell death. Natural killer (NK) cell-based immunotherapy has the ability to enhance the anticancer effects of PDT. The NK cell family 2 member D/ligand (NKG2D/NKG2DL) pathway acts as a
To synthesize MRPL-SC, DSPE-PEG(3400)-MRP-β-CD with an MMP-2 cleavable sequence was formed via multistep reactions. Then, MRPL-SC, combined with β-cyclodextrin (β-CD) containing SB-3CT to suppress the overexpressed MMP-2 that is tightly associated with the tumor NK-related escape mechanism in the tumor microenvironment and photosensitizer Ce6-loaded liposomes, was prepared using the film dispersion and extrusion method. The multi-responsive release ability of SB-3CT triggered by the MMP-2 abundant tumor microenvironment and chlorin e6 (Ce6) by 660 nm laser irradiation was studied in vitro. Cellular uptake, ROS generation, and the synergistic anti-tumor effects of MRPL-SC-mediated PDT and enhanced NK immunotherapy were studied in A375 cells, followed by the analysis of NKG2DLs expression. In addition, the anti-tumor efficiency and safety of MRPL-SCs were studied in tumor-bearing nude BALB/c mouse models.
The prepared MRPL-SC exhibited a typical liposome structure with a phospholipid bilayer and formed single/double-layer vesicles for drug encapsulating and intracellular delivering with a particle size about 160-170 nm (Fig. 2). Then, the MMP-2-responsive polypeptide linker was hydrolyzed by MMP-2, and SB-3CT encapsulated in β-CD was rapidly released, with accumulation reaching 72.26% after 240 min, indicating the responsiveness of MRPL-SC to the MMP-2 abundant tumor extracellular microenvironment. The released SB-3CT effectively regulated the expression of NKG2DLs and generation of soluble NKG2DLs in tumor tissues by directly inhibiting MMP-2 in situ. Ce6-encapsulated liposomes entered the tumor cells through endocytosis and induced severe cytotoxicity by PDT under 660 nm laser irradiation (Fig.5). In addition, Ce6-PDT also induced NKG2DLs expression, thereby realizing spatiotemporal synergistic enhancement of NK immunity in tumor tissues (Fig. 6). By employing the A375 tumor-bearing nude mice xenograft model, MRPL-SCs showed higher amounts of aggregation in tumor tissue and efficiently suppressed melanoma growth after laser irradiation (Fig. 8) without significant cytotoxic effects in the major organs.
In this study, a novel multi-responsive nanoliposome composed of photosensitizer Ce6-liposomes and MMP-2 antagonist SB-3CT linked by MMP-2 responsive peptide was successfully fabricated via film dispersion and extrusion. The synergistic anti-tumor effect of MRPL-SC-mediated PDT and NK cell immune enhancement was observed in both melanoma cells and nude mouse xenograft models. This study not only developed a new multi-responsive nanocomplex for better integration of PDT and immunotherapy but also elucidated a novel paradigm for NK cell-mediated photodynamic immunotherapy for melanoma.
1 引言
黑色素瘤是免疫原性最强的实体瘤之一,其较强的转移性导致现有疗法难以提高患者的长期生存率[1],因此,开发多种新的有效的抗肿瘤治疗方法至关重要。光动力疗法(PDT)是一种新型的无创治疗恶性肿瘤的技术,已被成功用于治疗非黑色素皮肤癌等。近年来,人们已经进行了多项体外和体内PDT研究,以检验PDT治疗黑色素瘤的疗效;结果表明,PDT有可能成为一种颇具潜力的黑色素瘤辅助治疗方法[2-3]。研究表明,PDT能通过诱导氧化应激和肿瘤细胞的免疫原性死亡,在治疗部位增强患者的抗肿瘤免疫反应,从而达到杀死肿瘤细胞的效果[4-5]。Chlorin e6(Ce6)是第二代光敏剂,在660 nm处有较强的吸收峰,在黑色素瘤[6]和鳞状细胞癌[7]等皮肤癌的临床试验中有显著疗效。虽然PDT策略开启了癌症治疗的新篇章,但单一治疗的反应率仍然很低,临床结果普遍不理想。大量研究证明了光动力-免疫联合疗法在实体瘤治疗上的优异效果以及对肿瘤转移的抑制作用[8-11]。
免疫疗法通过阻断被肿瘤劫持的负向免疫调控通路重新激活肿瘤免疫,进而通过机体免疫清除肿瘤。该疗法对中晚期肿瘤具有显著抑制作用,已逐步成为临床治疗中不可或缺的替代疗法之一,并被广泛用于黑色素瘤治疗。自然杀伤(NK)细胞是人体抵御肿瘤细胞和传染性病原体的第一道免疫防线,可以通过其激活信号和抑制信号之间的平衡识别并杀伤遭受“压力”的细胞,从而在没有抗原呈递或预刺激的情况下快速作用于靶细胞[12]。NK细胞在黑色素瘤肿瘤免疫监视中发挥着关键作用。此外,NK细胞免疫疗法已被证明可通过诱导全身性抗肿瘤免疫反应来提高PDT的肿瘤杀伤效果[13]。越来越多的动物实验和临床试验也表明PDT可以增加局部肿瘤组织和外周血中NK细胞的数量[14-15]。因此,PDT和NK细胞免疫治疗的协同作用是一个值得进一步研究的方向。
虽然NK细胞免疫重建能够显著改善肿瘤患者的存活率,但自体NK细胞的过继转移在进展性Ⅳ期黑色素瘤患者中并没有临床反应[16],患者的NK细胞功能受损,而NK细胞功能受损与疾病进展阶段、不良预后有关。对于NK细胞而言,其治疗抗性主要是由活性NK细胞数量少、寿命短、持久性和运输性差以及缺乏特异性肿瘤靶向性引起的[17]。肿瘤细胞除了可以通过改变NK细胞激活受体和抑制受体之间的平衡形成抑制NK细胞活性的微环境之外,还能介导MHC Ⅰ类分子相关蛋白A(MICA)、MHC Ⅰ类分子相关蛋白B(MICB)等NKG2D配体(NKG2DLs)脱落,并能招募抑制性免疫细胞。NK细胞相关免疫治疗的疗效在很大程度上取决于NK细胞表面所表达的NKG2D对靶细胞表面NKG2DLs(包括MICA、MICB和ULBP1-6等)的识别。肿瘤细胞通常通过MICA和MICB蛋白水解使细胞表面的NKG2DLs脱落,逃避NK细胞的识别杀伤。当肿瘤细胞表面的MICA和MICB脱落被小分子抑制剂特异性阻断时,NK细胞的抗肿瘤免疫就可以被重新激活[18]。基质金属蛋白酶(MMPs),尤其是MMP-2,在多种形式的癌症中过度表达。MMPs不仅与肿瘤的进展和转移有关,还参与NKG2DLs从肿瘤细胞表面脱落的过程[19],因此靶向MMP-2可能会通过调控NKG2DLs的表达促进NK细胞免疫应答。鉴于此,本团队假设MMP-2拮抗剂可以抑制NKG2DLs的脱落,从而增加NKG2DLs在肿瘤细胞表面的暴露,促进NK细胞对癌细胞的识别途径的激活。SB-3CT是一种高选择性明胶酶抑制剂,可特异性抑制MMP-2和MMP-9[20],可能成为NK免疫通路的潜在激动剂,这在以往的研究中很少提及。响应性触发的纳米载体同时负载光敏剂和免疫药物后,可在提升药物稳定性和靶向性的同时,通过时空触发的定向药物释放提升PDT与免疫治疗的协同治疗效果。
基于此,本团队设计了一种对肿瘤微环境和光双重响应的纳米颗粒——MMP-2响应多肽混合脂质体(MRPL-SC),以实现Ce6介导的PDT和SB-3CT增强的基于NKG2D的免疫治疗的协同抗肿瘤作用,并实现负载药物的时空可控释放。MRPL-SC由两部分复合而成,即:负载Ce6的纳米脂质体以及通过MMP-2响应多肽与脂质体连接的包封SB-3CT的β-CD。细胞外肿瘤微环境中过表达的MMP-2会触发β-CDs的分离和SB-3CT的释放。释放的SB-3CT会通过抑制MMP-2表达来抑制可溶性NKG2DLs的脱落,并增加NKG2DLs在肿瘤细胞表面的暴露。负载Ce6的脂质体被黑色素瘤细胞内吞后,采用660 nm激光照射激活其PDT效应,持续的PDT效应会触发脂质体内Ce6的释放和肿瘤细胞的凋亡/坏死。Ce6-PDT诱导的细胞凋亡与SB-3CT对NKG2D/NKG2DL通路的调节相结合,在黑色素瘤细胞和肿瘤异种移植裸鼠模型中显示出了优异的协同抗肿瘤效率和NK免疫应答。
2 实验材料与方法
2.1 MMP-2响应肽(MRP)、MRP-β-CD、DSPE-PEG(3400)-MRP-β-CD的合成
MMP-2响应肽(序列为Ac-CSSSGPLGIAGQSSS-OH)由上海淘普生物科技有限公司通过Fmoc固相肽合成法合成。称取10 mg多肽溶解于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中,加入100 mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌2 h,然后将17 mg氨基修饰的β-CD(NH2-β-CD)和1%(体积分数)三乙胺(TEA)添加到上述溶液中并在氮气保护下室温搅拌过夜,通过透析(截留分子量MWCO:2000 Da,1 Da=1 u)去除过量的NH2-β-CD。将产物冻干,并采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对产物进行分析。
用DSPE-PEG(3400)对MRP-β-CD进行进一步修饰:将15 mg MRP-β-CD和20 mg DSPE-PEG(3400)-Mal溶解在2 mL DMSO中,将反应混合物在氮气保护下室温搅拌过夜,通过透析(MWCO:3500 Da)去除过量的MRP-β-CD。产物冻干后进行MALDI-TOF MS分析。
2.2 制备MMP-2响应性纳米脂质体(MRPLs)和载药以形成MRPL-SC
Ce6脂质体通过薄膜水合法制备:将DPPC、DSPE-PEG(3400)-Mal、DSPE-PEG(3400)-MRP-β-CD和胆固醇以60∶10∶5∶15的质量比(总质量为12 mg)溶解于氯仿中,然后加入溶于丙酮中的5 mg/mL 的Ce6,孵育5 min;在氮气保护下去除CHCl3(以形成薄的磷脂膜),加入1 mL PBS,在48 ℃下水合20 min,用小型挤出机系统通过100 nm聚碳酸酯膜挤出11次,获得粒径均匀的MRPL-C脂质体,透析去除未包封的Ce6。将SB-3CT逐滴加入MRPL-C溶液中,超声5 min后室温孵育1 h,以10000g的离心力离心10 min后收集MRPL-SC。使用低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)表征脂质体的形态,通过动态光散射仪(DLS)测量粒径分布、Zeta电位和多分散指数(PDI)。
MRPL-SC中Ce6的包封率通过Ce6的荧光强度进行评估,SB-3CT的包封率间接通过上清液中SB-3CT的残留量来评估。包封率EE定义为装载药物质量占所加药物总质量的百分比
2.3 体外MMP-2响应和光响应药物释放
为了评估MRPLs的MMP-2响应特性,将1 mL MRPL-SC与100 μL重组人MMP-2(rhMMP-2,0.2 μg/mL)在37 ℃ TCNB溶液(50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,150 mmol/L NaCl,0.05% Brij 35,pH 7.5)中孵育3 h。采用Cryo-TEM表征脂质体的形态,采用DLS对粒径进行表征。将1 mL MRPL-SC分别与1 mL含有0、0.05、0.1、0.2 µg/mL rhMMP-2的TCNB溶液的混合物放入透析管(MWCO:100 kDa)中,透析液为30 mL PBS,将透析管置于摇床上(37 ℃,200 r/min)。
光触发的Ce6释放:将装有2 mL MRPL-SC的透析管(MWCO:100 kDa)放于30 mL PBS透析液中进行透析,温度为37 ℃;透析2 h后,使用660 nm连续激光(50 mW/cm2,5 min)照射MRPL-SC。在不同的时间点,从透析装置的外部介质中取出1 mL溶液,并重新添加相同体积的PBS。SB-3CT和Ce6的释放量分别通过紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪进行测定。
2.4 单线态氧生成
使用荧光1O2探针Singlet Oxygen Sensor Green(SOSG)测量MRPL的单线态氧(1O2)产量。将SOSG(终浓度,10 μmol/L)与1 μg/mL Ce6或MRPL-SC(含1 μg/mL Ce6)混合,并于660 nm激光下照射(50 mW/cm2)5 min。采用荧光光谱法(发射波长λex=504 nm,激发波长λem=525 nm)测量荧光强度。
2.5 细胞对MMP-2响应脂质体的内吞和ROS生成
A375(人皮肤黑色素瘤细胞系)肿瘤细胞购自National Collection of Authenticated Cell Cultures,将其置于含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。A375细胞分别用游离Ce6和MRPL-Ce6(Ce6质量浓度为10 μg/mL)处理0、4、6、8 h,然后与4%甲醛孵育,孵育结束后再使用1.0 μg/mL DAPI染色。采用荧光显微镜观察样品并拍照。
采用荧光显微镜监测A375细胞内活性氧(ROS)的生成,将二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针。将A375细胞以1×105 cell/mL的密度接种在共聚焦培养皿中,并与1 μg/mL Ce6、MRPL-C(含有1 μg/mL Ce6)一起孵育4 h。未经处理的细胞被视为对照组。孵育结束后,用PBS洗涤细胞,然后用660 nm激光(50 mW/cm2)照射细胞5 min。根据检测试剂盒的说明书进行分析,采用荧光显微镜监测ROS信号(λex=488 nm,λem=520 nm)。
2.6 体外细胞毒性
使用CCK-8测定、评估细胞活力:将100 μL A375细胞以1×105 cell/mL的密度接种于96孔板中培养过夜,然后加入100 μL用培养基稀释的含有不同浓度Ce6和SB-3CT的MRPLs;6 h后,采用660 nm激光(50 mW/cm2,5 min)照射细胞,对照组置于暗处;24 h后每孔加入1% CCK-8,采用酶标仪检测450 nm处的吸光度值,计算细胞存活率。细胞存活率Cv的计算公式为
式中:Asample是指经不同浓度脂质体处理后的细胞在450 nm波长下的吸光度(OD);Acon是指未经任何处理的细胞在450 nm波长下的吸光度;Ablank是指培养基与CCK-8溶液在450 nm波长下的吸光度。
采用Calcein-AM/PI活死细胞共染色评估MRPLs的细胞毒性:将A375细胞接种于35 mm直径的共聚焦培养皿中,与空白MRPLs、MRPL-S、MRPL-C和MRPL-SC共孵育6 h;孵育结束后用PBS清洗,激光照射后24 h用Calcein-AM(活细胞)和碘化丙啶(PI,死细胞)避光染色30 min,然后在荧光显微镜下观察(Calcein AM显示绿色荧光,λex=494 nm,λem=517 nm;PI显示红色荧光,λex=535 nm,λem=617 nm)。
2.7 NKG2D/NKG2DL通路分子机制
用Western Blot检测NKG2DLs蛋白表达:1)将A375细胞接种于6孔板中培养过夜,然后加入MRPLs、MRPL-S、MRPL-C和MRPL-SC;2)24 h后用PBS洗涤细胞两次,每组细胞用含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RAPI裂解液在冰上裂解10 min,接着离心5 min(离心力为10000g),取上清液用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量;3)蛋白定量后,将20 µg蛋白质样品在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳,然后将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜(NC)上;4)室温下,将NC膜于封闭溶液(5%脱脂奶粉)中预孵育1 h,接着将NC膜与兔抗人单克隆抗体MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2、MMP-2和MMP-9(1∶1 000)在4 ℃过夜,β-actin作为内参;5)用含有0.1% Tween-20的Tris缓冲液(TBST)洗涤三次,每次10 min,将NC膜与山羊抗兔的HRP-Ig G于室温下孵育1 h,孵育结束后用TBST洗涤三次,将膜与化学发光试剂盒(Pierce ECL)的底物一起孵育。用ClinxChemiScope捕获图像,用Image-Pro Plus测量灰度带值。
A375细胞用MRPLs、MRPL-S、MRPL-C和MRPL-SC处理24 h和48 h后分别收集细胞培养上清液,进行酶联免疫吸附实验(ELISA),使用Human MICA ELISA试剂盒和Human MICB ELISA试剂盒检测MICA和MICB的浓度。简言之,首先根据试剂盒说明制备标准浓度的MICA和MICB,将标准液和样品各100 μL添加到抗MICA/B包被的微孔板中,然后依次加入生物素化检测抗体和辣根过氧化物酶-链霉素抗生素溶液,最后加入显色液和终止液,在450 nm处检测吸光度值。以标准液浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,根据样品的吸光度值计算浓度。
2.8 NK细胞介导的细胞毒性
使用乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法测量NK细胞介导的细胞毒性:1)用MRPLs、MRPL-S、MRPL-C和MRPL-SC处理细胞,24 h后收集细胞并计数,并用完全培养基将收集的A375细胞密度调至1×105 cell/mL;2)采用同样的方法计数NK细胞,并根据不同效靶比调节NK细胞的浓度;3)将A375细胞和NK细胞各100 μL加入96孔板中,混合均匀,每个样品3个复孔,同时设置A375最大释放组和A375细胞自然释放组作为对照组;4)孵育4 h后离心,将100 μL上清液转移到新的96孔板中;5)根据说明书,用LDH检测试剂盒检测上清液中释放的LDH。NK细胞杀伤率Lysis的计算公式为
式中:Lysis为NK细胞的杀伤率;Aexp为实验组上清液的吸光度值;
2.9 体内荧光成像
BALB/c裸鼠(4~6周龄,17 g±4 g)购于西安科奥克生物科技有限公司,用于构建荷瘤裸鼠模型。所有动物试验均得到了西安交通大学动物伦理委员会的批准。将悬浮于100 μL PBS中的共1×106个A375细胞皮下注射到小鼠右侧腿部皮下组织中。当肿瘤体积长大到约200 mm3时,使用LVIS SPEC成像系统对小鼠进行体内荧光成像。肿瘤体积的计算公式为:V=L×W2/2(V表示体积,L表示长,W表示宽)。将Ce6和MRPL-SC(100 μL,200 μmol/L Ce6)静脉注射到荷瘤小鼠体内,注射后0、2、8、12、24 h,采用IVIS Spectrum对小鼠进行成像。注射后24 h处死小鼠,对小鼠进行解剖,并对肿瘤组织和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)进行离体成像(λem=645 nm,λex=680~720 nm)。
2.10 体内抗肿瘤功效
为了评估MRPL-SC的抗肿瘤效率和安全性,将A375细胞(每只裸鼠1×106个细胞)皮下注射到右侧腿部构建A375荷瘤裸鼠模型。当肿瘤体积长大到约50 mm3时,将裸鼠随机分为5组,分别为生理盐水组(NS组)、MRPL-S组、MRPL-C+laser组、MRPL-SC组、MRPL-SC+laser组,每组8只。尾静脉注射100 μL治疗制剂(SB-3CT的给药剂量为50 mg/kg,Ce6质量浓度为200 μg/mL),MRPL-C+laser组和MRPL-SC+laser组在注射后24 h和48 h分别用660 nm激光照射肿瘤部位(200 mW/cm2,10 min)。将注射药物的当天定义为第0天,每3或4天记录一次小鼠体重和肿瘤体积。根据测量的数据计算裸鼠的相对肿瘤体积,以给药时间为对照。治疗结束后,以生理盐水组的肿瘤体积为100%,计算相对肿瘤增殖率。
为了验证药物的治疗效果,静脉注射药物并照射后48 h(即第4天),每组随机选取2只小鼠处死,并收集肿瘤组织。将肿瘤组织在多聚甲醛组织固定液中进行固定,然后进行石蜡包埋和切片处理,最后进行苏木精伊红(H&E)染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色,以评估治疗效果。
将治疗的第14天定义为治疗终点。治疗结束后处死所有小鼠,取肿瘤组织称重。为了评估脂质体制剂的全身毒性,收集主要器官(心、肝、脾、肺、肾)进行固定、石蜡包埋、切片、H&E染色处理,以进行组织病理学分析。
2.11 统计学分析
使用GraphPad Prism 9对结果进行统计分析。结果表示为平均值±标准差(SD)。使用单因素方差分析进行多组之间的比较。统计显著性定义为P<0.05(*)、P<0.01(**)和P<0.001(***)。
3 实验结果与讨论
3.1 MRPL-SC的制备和表征
MRPL-SC的合成示意图及作用机制如
图 1. MRPL-SC脂质体的作用示意图。(a)MRPL-SC合成及MMP-2响应性释放;(b)MRPL-SC在肿瘤中的双重反应药物释放及改善光动力免疫治疗的机制
Fig. 1. Schematic diagrams of MRPL-SC liposomes. (a) MRPL-SC synthesis and MMP-2 responsive release; (b) dual-responsive drug release and mechanisms to improve photodynamic immunotherapy of MRPL-SC in tumor
图 2. MALDI-TOF质谱检测结果。(a)MRP;(b)MRP-β-CD;(c)DSPE-PEG(3400)-Mal;(d)DSPE-PEG(3400)-MRP-β-CD
Fig. 2. MALDI-TOF spectrometry detection results. (a) MRP; (b) MRP-β-CD; (c) DSPE-PEG(3400)-Mal; (d) DSPE-PEG(3400)-MRP-β-CD
如
图 3. MRPL-SC的表征。(a)MRPL-SC合成示意图;(b)MRPL-C和加载SB-3CT后MRPL-SC的粒径分布及Cryo-TEM形貌表征;(c)游离SB-CT、Ce6及脂质体的紫外可见光谱,blank组不包封药物,MRPL-C仅包封Ce6,MRPL-S仅包封SB-3CT,MRPL-SC包封Ce6和SB-3CT;(d)单线态氧产量
Fig. 3. Characterization of MRPL-SC. (a) Synthesis schematic of MRPL-SC; (b) particle size distributions and Cryo-TEM characterization of MRPL-C and MRPL-SC loaded with SB-3CT; (c) UV-vis spectra of free SB-CT, Ce6 and liposomes, where blank loads no drug, MRPL-C loads only Ce6, MRPL-S loads only SB-3CT, and MRPL-SC loads both Ce6 and SB-3CT; (d) singlet oxygen generation
Ce6单线态氧的量子产率高,表现出了极其出色的PDT效率,但其水溶性差,生理状态下易聚集,从而影响其细胞杀伤效果。通过SOSG荧光探针对Ce6单线态氧的生成进行评估,结果如
3.2 MRPL-SC双重响应药物释放
图 4. MRPL的MMP-2响应性。(a)MRPL-SC响应MMP-2释放药物示意图;(b)MRPL-SC与rhMMP-2孵育后的粒径分布和Cryo-TEM图像;(c)在不同质量浓度MMP-2下孵育的MRPL-SC的SB-3CT释放曲线;(d)激光触发前后的Ce6释放
Fig. 4. MMP-2 responsiveness of MRPL. (a) Drug release schematic illustration of MRPL-SC with MMP-2 responsive; (b) particle size distributions and Cryo-TEM images of MRPL-SC incubated with rhMMP-2; (c) SB-3CT release curves of MRPL-SC incubated with different mass concentrations of MMP-2; (d) Ce6 release before and after laser triggering
本文评估了MRPL-SC中Ce6的光触发释放特性,结果如
3.3 细胞MRPL-SC摄取和体外细胞毒性
内吞是纳米颗粒进入细胞的关键途径。众所周知,PDT主要通过相当有限浓度范围内的光敏剂(<0.1 μmol/L)产生活性氧来发挥光敏剂的细胞毒性作用[23]。因此,Ce6的有效摄取是探索光敏剂作用机制的先决条件。可以用Ce6的荧光强度表征A375细胞对MRPL-SC的摄取能力。由
图 5. 体外MRPLs的细胞摄取和细胞毒性。(a)A375细胞摄取Ce6的荧光图像(比例尺:10 μm);(b)A375细胞摄取Ce6的荧光强度的相对定量分析;(c)不同处理后A375细胞产生的ROS的荧光图像;(d)A375经MRPL处理后在无光照条件的细胞活力;(e)A375经MRPL处理后在光照条件下的细胞活力
Fig. 5. Cellular uptake and cytotoxicity of MRPLs in vitro. (a) Fluorescent images of Ce6 uptake by A375 cells (scale bar: 10 μm); (b) relative quantitative analysis of fluorescence intensity of Ce6 uptake by A375 cells; (c) fluorescent images of ROS produced by A375 cells after different treatments; (d) cell viability of A375 cells treated by MRPL without laser irradiation; (e) cell viability of A375 cells treated by MRPL with laser irradiation
接下来对细胞内ROS的产生进行分析。ROS产生是PDT效应的主要作用机制,ROS可以破坏质膜和细胞器,导致肿瘤细胞自噬、凋亡和坏死。由
用于生物医学的纳米脂质体在递送药物的同时应具有良好的生物相容性和治疗效果。为了评估MRPLs的细胞毒性和生物活性,通过CCK-8法检测A375细胞的活力。采用空载MRPLs(blank)处理A375细胞没有诱导明显的细胞毒性,如
接下来通过计算MRPL-SC中Ce6与SB-3CT的IC50结合指数(CI)来分析药物间的协同作用。由之前的报道可知:若CI等于1,说明两种药物为加性作用;若CI值大于1,说明两种药物具有拮抗作用;若CI值小于1,说明两种药物具有协同作用[25]。对于MRPL-SC而言,CI的计算公式为CI=IC50(SB-3CT in MRPL-SC+laser)/IC50(SB-3CT in MRPL-SC)+IC50(Ce6 in MRPL-SC+laser)/IC50(Ce6 in MRPL-C+laser)。根据CCK-8细胞杀伤结果,上述IC50值依次为13.58 μmol/L、109.4 μmol/L、6.789 μg/mL和8.688 μg/mL。经计算可得MRPL-SC的CI值为0.8916,这一结果表明MRPL-SC介导的光动力疗法(Ce6-PDT)和免疫疗法(SB-3CT)具有协同作用。
3.4 NKG2D/NKG2DL通路机制研究
Ce6-PDT能够引发多种急性应激反应,改变线粒体的功能,而线粒体是负责诱导细胞凋亡的细胞器[26]。因此,诱导细胞凋亡是Ce6-PDT作用于肿瘤细胞的主要机制。SB-3CT在MRPL-SC中的主要机制不是诱导黑色素瘤细胞凋亡,而是调节MMP-2的表达并进一步影响NKG2D通路,进而调控NK细胞的杀伤作用。由
图 6. MRPLs处理的A375细胞中的NKG2D/NKG2DL通路机制。(a)MRPLs处理后有或无激光参与时NKG2D/NKG2DL通路的蛋白表达;(b)与MRPLs共孵育48 h后的A375细胞脱落的可溶性MICA(sMICA)和MICB(sMICB);(c)MRPL-SC上调A375细胞表面NKG2DLs的表达信号通路;(d)不同效靶比下NK细胞的杀伤作用(比例尺:100 μm);(e)效靶比为4∶1时NK细胞介导的对A375细胞的细胞毒性
Fig. 6. Mechanism of NKG2D/NKG2DL pathway in A375 cells treated with MRPLs. (a) Protein expression of NKG2D/NKG2DL pathway after MRPLs treatment with or without laser; (b) soluble MICA and MICB shedding from A375 cells treated with MRPLs after 48 h incubation; (c) proposed signaling pathway of MRPL-SC upregulating the expression of NKG2DLs on the surface of A375 cancer cells; (d) killing effect of NK cells at different effector-target ratios (scale bar: 100 μm); (e) NK cell-mediated cytotoxicity to A375 cells at effector-target ratio of 4∶1
NK细胞对靶细胞的杀伤作用主要取决于NK细胞表面抑制性受体与激活性受体之间的平衡,当靶细胞表面活性受体的配体表达增加时,NK细胞的激活性受体占据主导地位,从而识别并杀伤肿瘤细胞。如
3.5 体内生物分布
长血液循环时间是治疗药物在肿瘤部位蓄积的前提条件,具有适当尺寸(直径为100~200 nm)的纳米颗粒比游离药物具有更长的血液保留时间[27]。通过小鼠尾静脉注射Ce6和MRPL-C纳米颗粒,使用体内荧光成像系统评估MRPL-C在A375荷瘤小鼠体内的分布。小鼠成像时间线示意图如
图 7. 尾静脉注射Ce6和MRPL-C后荷瘤裸鼠体内荧光成像和生物分布分析。(a)荷瘤小鼠成像时间线示意图;(b)静脉注射Ce6和MRPL-C后不同时间点A375荷瘤小鼠的体内荧光成像;(c)静脉注射24 h后主要器官和解剖肿瘤的荧光强度
Fig. 7. In vivo fluorescence imaging and biodistribution analysis of nude mice bearing tumors after tail vein injection of Ce6 and MRPL-C. (a) Schematic diagram of tumor-bearing mouse imaging; (b) in vivo fluorescence imaging of A375-bearing mice after intravenous injection of Ce6 and MRPL-C nanoparticles at different times; (c) fluorescence intensity of major organs and tumor dissection 24 h after intravenous injection
3.6 体内抗肿瘤效果研究
基于MRPL-SC的抗肿瘤能力及其在肿瘤部位的良好积累,接下来针对A375荷瘤裸鼠评估MRPL-SC的体内抗肿瘤效果,以证明MRPL-SC的Ce6-PDT与NKG2D通路介导的免疫疗法的协同治疗作用。如
图 8. MRPL-SC体内抗肿瘤效果(**P<0.01,***P<0.001)。(a)荷瘤裸鼠治疗时间线示意图;(b)14 d治疗期间不同治疗组的肿瘤体积变化;(c)不同治疗组的荷瘤裸鼠的相对肿瘤增殖率;(d)不同治疗组解剖肿瘤的质量(n=5);(e)照射2 d后不同治疗组肿瘤切片的H&E染色和TUNEL染色结果
Fig. 8. In vivo anti-tumor effect of MRPL-SC (**P < 0.01, ***P < 0.001). (a) Schematic illustration of in vivo therapeutic time line on tumor-bearing mouse; (b) tumor volume change of mice (n=6) from various treatment groups during 14 d treatment; (c) relative tumor proliferation rate of tumor-bearing mouse in different treatment groups; (d) tumor weight of tumor in different treatment groups; (e) H&E and TUNEL staining of tumor sections of different treatment groups excised two days after irradiation
14 d后处死所有小鼠,取出肿瘤并称重,称量结果如
为了进一步评估MRPL-SC的协同治疗效果,治疗结束后,收集并固定不同组的肿瘤组织,通过H&E和TUNEL染色研究肿瘤的组织学损伤以及肿瘤的凋亡水平。由
3.7 体内安全性研究
为了评估MRPL-SC的安全性,在治疗结束后取裸鼠的主要器官进行H&E染色。如
图 9. 不同处理的荷瘤小鼠主要器官的H&E染色结果(比例尺:50 μm)
Fig. 9. H&E staining results of major organs of tumor-bearing mice for different treatments (scale bar: 50 μm)
此外,还有几点需要考虑:1)不同的NKG2DLs是否通过不同的机制调节免疫反应和肿瘤微环境;2)NKG2DLs是否不仅可以直接杀死肿瘤细胞,还可以通过影响免疫细胞的相互网络来协调免疫反应。例如,NKG2D是NK细胞上的激活受体,同时它还可以在CD8+ T细胞上作为共刺激受体表达。此外,新的联合治疗研究表明,SB-3CT可以提高抗PD-1和抗CTLA-4在黑色素瘤小鼠模型以及肺转移性黑色素瘤治疗上的效果。值得注意的是,如今癌症免疫疗法也普遍依赖于细胞毒性淋巴细胞(CTL和NK细胞)的功能。检查点抑制剂,例如针对PD-1、PD-L1或CTLA-4的抗体,可以增强CTL和NK细胞对肿瘤的反应,临床结果也比较满意[29]。MPRL-SC增强的光动力免疫治疗可以进一步与其他免疫治疗策略相结合,实现更好的黑色素瘤抗肿瘤效果。
4 结论
本文报道了一种基于PDT和NKG2D的免疫疗法的程序化组合疗法,构建了一种封装光敏剂Ce6和MMP-2抑制剂SB-3CT的多响应纳米脂质体(MRPL-SC),用于黑色素瘤的有效治疗。全身给药后,MRPL-SC能在肿瘤部位积累并长期保留,使SB-3CT能在MMP-2过表达的肿瘤细胞微环境中特异性释放以抑制MMP-2表达,Ce6脂质体被肿瘤细胞内吞后释放光敏剂并在660 nm光照下触发PDT。采用A375细胞和裸鼠异种移植肿瘤模型证明了激光照射后MRPL-SC不仅可以有效抑制黑色素瘤的生长和迁移,还可以显著提高NK细胞的抗肿瘤免疫作用。考虑到PDT疗法已经被用于黑色素瘤的临床治疗,并且所设计的纳米脂质体中的主要成分都是美国食品药品监督管理局(FDA)批准或正在临床试验中的药物,故而认为MRPL-SC介导的光动力-免疫联合疗法可能是一种颇具前途的黑色素瘤和其他癌症的治疗方法。
[1] BrayF, FerlayJ, SoerjomataramI, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA: a Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68(6): 394-424.
[2] Dummer R, Hauschild A, Pentheroudakis G, et al. Cutaneous malignant melanoma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up[J]. Annals of Oncology, 2009, 20: iv129-iv131.
[3] 李步洪, 陈天龙, 林立, 等. 光动力疗法基础研究与临床应用的新进展[J]. 中国激光, 2022, 49(5): 0507101.
[4] Kousis P C, Henderson B W, Maier P G, et al. Photodynamic therapy enhancement of antitumor immunity is regulated by neutrophils[J]. Cancer Research, 2007, 67(21): 10501-10510.
[5] 刘庄, 冯良珠. 光功能纳米材料与肿瘤光学治疗展望[J]. 发光学报, 2020, 41(11): 1339-1342.
[6] Kim S, Kim S A, Nam G H, et al. In situ immunogenic clearance induced by a combination of photodynamic therapy and Rho-kinase inhibition sensitizes immune checkpoint blockade response to elicit systemic antitumor immunity against intraocular melanoma and its metastasis[J]. Journal for Immunotherapy of Cancer, 2021, 9(1): e001481.
[7] Nasr S, Rady M, Sebak A, et al. A naturally derived carrier for photodynamic treatment of squamous cell carcinoma: in vitro and in vivo models[J]. Pharmaceutics, 2020, 12(6): 494.
[8] Yang W J, Zhang F W, Deng H Z, et al. Smart nanovesicle mediated immunogenic cell death through tumor microenvironment modulation for effective photodynamic immunotherapy[J]. ACS Nano, 2019, 14(1): 620-631.
[9] Cheng H W, Fan X S, Ye E Y, et al. Dual tumor microenvironment remodeling by glucose-contained radical copolymer for MRI-guided photoimmunotherapy[J]. Advanced Materials, 2022, 34(25): e2107674.
[10] He S S, Li J C, Cheng P H, et al. Charge-reversal polymer nano-modulators for photodynamic immunotherapy of cancer[J]. Angewandte Chemie (International Ed. in English), 2021, 60(35): 19355-19363.
[11] Xiao M, Fan J L, Li M, et al. A photosensitizer-inhibitor conjugate for photodynamic therapy with simultaneous inhibition of treatment escape pathways[J]. Biomaterials, 2020, 257: 120262.
[12] Liu H F, Wang S J, Xin J, et al. Role of NKG2D and its ligands in cancer immunotherapy[J]. American Journal of Cancer Research, 2019, 9(10): 2064-2078.
[13] Korbelik M, Sun J H. Cancer treatment by photodynamic therapy combined with adoptive immunotherapy using genetically altered natural killer cell line[J]. International Journal of Cancer, 2001, 93(2): 269-274.
[14] Theodoraki M N, Lorenz K, Lotfi R, et al. Influence of photodynamic therapy on peripheral immune cell populations and cytokine concentrations in head and neck cancer[J]. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2017, 19: 194-201.
[15] Deng G J, Sun Z H, Li S P, et al. Cell-membrane immunotherapy based on natural killer cell membrane coated nanoparticles for the effective inhibition of primary and abscopal tumor growth[J]. ACS Nano, 2018, 12(12): 12096-12108.
[16] Parkhurst M R, Riley J P, Dudley M E, et al. Adoptive transfer of autologous natural killer cells leads to high levels of circulating natural killer cells but does not mediate tumor regression[J]. Clinical Cancer Research, 2011, 17(19): 6287-6297.
[17] Barth M J, Chu Y Y, Hanley P J, et al. Immunotherapeutic approaches for the treatment of childhood, adolescent and young adult non-Hodgkin lymphoma[J]. British Journal of Haematology, 2016, 173(4): 597-616.
[18] Luo D, Dong X W, Yan B, et al. MG132 selectively upregulates MICB through the DNA damage response pathway in A549 cells[J]. Molecular Medicine Reports, 2019, 19(1): 213-220.
[19] Yang F Q, Liu M, Yang F P, et al. Matrix metallopeptidase 2 (MMP2) mediates MHC class I polypeptide-related sequence A (MICA) shedding in renal cell carcinoma[J]. Actas Urológicas Españolas, 2014, 38(3): 172-178.
[20] Tao P, Fisher J F, Mobashery S, et al. DFT studies of the ring-opening mechanism of SB-3CT, a potent inhibitor of matrix metalloproteinase 2[J]. Organic Letters, 2009, 11(12): 2559-2562.
[21] Nagase H, Fields G B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptides[J]. Biopolymers, 1996, 40(4): 399-416.
[22] Kobayashi H, Watanabe R, Choyke P L. Improving conventional enhanced permeability and retention (EPR) effects; what is the appropriate target?[J]. Theranostics, 2013, 4(1): 81-89.
[23] 李西鹏, 张涛. 细胞器靶向光敏剂的研究进展[J]. 激光生物学报, 2020, 29(4): 295-301.
[24] Luo M Y, Li H X, Han D H, et al. Inhibition of autophagy enhances apoptosis induced by Ce6-photodynamic therapy in human colon cancer cells[J]. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2021, 36: 102605.
[25] Ding L, Lin X, Lin Z G, et al. Cancer cell-targeted photosensitizer and therapeutic protein co-delivery nanoplatform based on a metal-organic framework for enhanced synergistic photodynamic and protein therapy[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2020, 12(33): 36906-36916.
[26] Mroz P, Yaroslavsky A, Kharkwal G B, et al. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer[J]. Cancers, 2011, 3(2): 2516-2539.
[27] 王瑞荣, 崔丹丹, 石玉娇. 光敏感AgBr@PLGA纳米探针用于近红外二区肿瘤特异性光声成像[J]. 中国激光, 2022, 49(20): 2007204.
[28] Liu C, Lai H Q, Chen T F. Boosting natural killer cell-based cancer immunotherapy with selenocystine/transforming growth factor-beta inhibitor-encapsulated nanoemulsion[J]. ACS Nano, 2020, 14(9): 11067-11082.
[29] Voskoboinik I, Whisstock J C, Trapani J A. Perforin and granzymes: function, dysfunction and human pathology[J]. Nature Reviews Immunology, 2015, 15(6): 388-400.
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刘慧芳, 雷栋钦, 秦奋, 王斯佳, 张镇西. 基于Ce6和MMP-2抑制剂的多级控释脂质纳米复合体用于光动力-免疫协同治疗黑色素瘤[J]. 中国激光, 2023, 50(3): 0307203. Huifang Liu, Dongqin Lei, Fen Qin, Sijia Wang, Zhenxi Zhang. Multi-Responsive Liposomal Nanocomplex Encapsulating Ce6 & MMP-2 Inhibitors for Photodynamic-Immune Synergistic Treatment of Melanoma[J]. Chinese Journal of Lasers, 2023, 50(3): 0307203.