1 引言

随着人们对疾病诊断要求的提高,特别是对早期病变组织进行无损伤诊断和对人类生命现象深入研究的要求,基于小动物肿瘤模型的无损成像研究具有极为重大的科学研究意义与临床应用价值^[1-3]。基于光声效应的光声成像方法是一种以超声为媒介的生物光子成像方法,该方法结合光学成像和声学成像的优点,即将光学方法的无损伤、高光学特异性和超声波的低衰减、高穿透性特点相结合。一方面,光声成像技术以组织的光学吸收系数为基础,组织内部的发色团对特定波长的激光具有差别较大的光学吸收系数,因此可实现高对比度成像;另一方面,与光相比,超声波在深度方向上受组织体散射效应的影响较低,可对深层组织进行高空间分辨率成像。光声成像方法具有灵活度高、穿透深度深和高分辨成像的特点,可以采用不同的成像方式获得与应用相匹配的优质图像^[4-6]。在光声成像方法中,基于声学聚焦的光声介观(OPAM)成像方法,即声学分辨率下的光声显微成像方法,能够实现对浅层(1~10 mm)组织的高分辨(10~100 μm)成像^[7-9]。该成像方法适用于肿瘤血管形态的结构成像、肿瘤内部氧饱和度的功能成像、靶向探针药物的分子成像等生物医学、影像学领域。

近年来,多个研究小组开展了对OPAM成像方法的研究,已证实该成像方法在生物医学领域中的重要应用价值^[10-13]。目前OPAM成像方法存在的主要问题是信噪比高,以及多角度测量数据同时获取能力欠缺。已发展的OPAM成像系统通常采用基于单超声探测器的光栅扫描系统^[10-11]和基于超声阵列的多角度层析扫描系统^[12-13]。前者所采用的单超声探测器可获得高信噪比的光声信号,但由于光栅二维扫描模式获得的光声信号缺少多角度信息,会在一定程度上降低重建图像的保真度;后者采用超声阵列可对光声信号进行多角度全方位的提取,但造价昂贵,并且与单超声探测器相比,超声阵列单个阵元的灵敏度和信噪比有一定的降低,会在一定程度上影响重建图像的质量。

本文搭建了一套面向小动物肿瘤模型成像的OPAM实验系统。该系统将高频聚焦超声探测器与多角度扫描方式相结合,前者可实现高灵敏度测量,后者则可实现对目标体信息的多角度获取。首先,通过仿体实验并采用结合虚拟点技术的反投影重建算法,验证系统的高分辨能力。为了获得肿瘤的结构性信息,本文采用705 nm波长下的脉冲激光照射肿瘤组织,获得基于活体小鼠的胰腺癌肿瘤和肝癌肿瘤的OPAM重建图像,对图像结果中的肿瘤特征进行分析,并通过双波长实验获得了肿瘤的血氧饱和度指标。实验结果表明,该OPAM系统可对活体小动物肿瘤模型进行高分辨成像,为OPAM成像技术在肿瘤学研究方面的深入探究提供了参考。

2 面向小动物肿瘤成像的OPAM实验系统

2.1 OPAM系统装置

OPAM系统的成像原理如图1所示。该成像系统利用波长为532 nm的 Nd∶YAG(Nimma-600)脉冲激光器将光泵浦至光学参量振荡器(OPO),以产生近红外范围内的脉冲激光,输出波长范围为680~1064 nm,脉冲重复频率为 10 Hz,脉冲持续时间为 8 ns。OPO出射的脉冲光通过光纤耦合传输至光纤束中,最终形成四面照明的宽场光照明模式。OPAM成像系统采用定制的中心频率为15 MHz,直径和焦距均为 6 mm(数值孔径NA=0.5)的球聚焦超声探测器来接收光声信号,通过与旋转台(M-060.PD, Physik Instrument)连接实现连续旋转扫描。实验中选择的测量范围为120°,测量时间为60 s。光声信号经过超声探测器转换为电信号,继而通过50 dB前置放大器放大后进入高速数据采集卡进行数据采集,其采样频率设置为100 MHz。信号最终传输至计算机进行数据存储与图像重建等处理。为了确保声速在水中的稳定性,实验中将加热元件放置在水箱中,以保持33 ℃的恒定温度。

图 1. OPAM系统原理图

Fig. 1. Schematic of OPAM system

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2.2 实验设计

为评估OPAM成像系统的成像分辨能力,首先对表面随机分布的直径为50 μm的聚乙烯微球仿体进行OPAM实验。采用与生物组织体具有类似光学散射系数的仿体进行实验,该圆柱形琼脂仿体由48.35 mL蒸馏水、1.5 g琼脂粉和1.65 mL的脂肪乳溶液(质量分数为10%)配比而成,形成约化散射系数为 1 mm^-1的背景。待仿体将要固化时,在其表面随机放置一些直径为50 μm的聚乙烯微球。其中琼脂粉起固化作用,脂肪乳溶液主要模拟组织中的散射物质,微球为主要的成像目标体。为验证本系统对活体小动物肿瘤成像的能力,采用体重约为20 g,4周大的BALB/c雄性裸小鼠进行成像实验。通过与天津市肿瘤医院合作,建立了鼠源胰腺癌细胞系和肝癌细胞系,将其接种至裸小鼠的侧腹部来构建皮下移植肿瘤模型。胰腺癌肿瘤模型和肝癌肿瘤模型均为6例。每隔3 d测量肿瘤的长度与宽度,当肿瘤体径长到5~10 mm时开始动物实验,本实验符合动物实验控制和监督委员会相关条例。实验过程为:1)用质量分数为4%的水合氯醛对裸小鼠进行腹腔麻醉(注射剂量为0.0075 mL/g);2)将裸小鼠固定在成像支架上,仅肿瘤部分自然垂落在成像支架的孔内;3)采用OPAM系统对肿瘤进行120°扫描测量,然后将裸小鼠取下。

3 结合虚拟点技术的反投影重建方法

基于OPAM系统的测量数据,利用目前光声领域中广泛使用的通用反投影重建方法^[14],对实验仿体和小鼠肿瘤进行重建。OPAM系统采用的高频宽带球聚焦超声探测器,可对一定孔径角内的光声信号进行高灵敏度接收。基于该OPAM实验系统,将反投影重建算法与虚拟点探测技术相结合,如图2所示。为尽量减少高频信号的衰减,探测器与目标体之间的探测距离设置较近,且保持探测器的焦点处于成像目标区域外适当位置,即R>F+r。在这种离焦测量模式下,直接将具有一定晶面尺寸的探测器等效为一个虚拟点探测器的误差较大。所搭建的OPAM系统中具有大数值孔径的高频宽带球聚焦超声探测器的焦点尺寸远小于其晶面尺寸,可近似为一个虚拟点探测器。结合虚拟点探测技术的反投影重建方法可以减少传统反投影方法在初始声压重建过程中由探测晶面造成的计算误差,提高重建图像质量。

图 2. 基于球聚焦超声探测器的离焦测量模式

Fig. 2. Out-of-focus measurement mode based on sphere-focused ultrasonic detector

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4 实验结果与分析

4.1 仿体实验

为验证OPAM成像系统的有效性,设计表面分布了一些直径为50 μm聚乙烯微球的琼脂仿体。实验中的激光波长设置为705 nm。随后,利用传统的反投影重建方法和结合虚拟点技术的反投影重建算法进行图像重建。图3为仿体实物图和图3(a)方框区域的成像结果。从图3(b)可以看出,采用传统的反投影重建方法获得的重建图像存在明显的伪影与失真,这是因为在探测距离较近的情况下,将探测器晶面等效为一个点探测器的假设无法成立。从图3(c)可以看出,结合虚拟点探测技术的反投影重建方法可以有效恢复出微球的分布与形状。

图 3. 仿体实验结果。(a)仿体实物图;(b)传统反投影方法的重建结果;(c)结合虚拟点技术的反投影重建结果

Fig. 3. Results of phantom experiment. (a) Photograph of phantom; (b) reconstructed result by traditional back-projection algorithm; (c) reconstructed result by modified back-projection algorithm combined with virtual point technique

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从图3(c)中随机选取三个微球,其x轴和y轴剖线如图4所示。通过计算得到微球的半峰全宽(FWHM)及平均值,如表1所示,系统在水平(x)方向和竖直(y)方向的分辨能力分别约为77.76 μm和88.50 μm。

图 4. 所选的3个微球的x轴和y轴剖线图。(a)(d)微球1;(b)(e)微球2;(c)(f)微球3

Fig. 4. Profiles of three microspheres along x and y directions. (a)(d) Microsphere 1; (b)(e) microsphere 2; (c)(f) microsphere 3

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4.2 小动物肿瘤模型实验

图5为活体小鼠肿瘤成像实物图。实验时采用的激光波长为705 nm,所得到的肿瘤部分重建结果如图6所示,重建区域大小为6 mm×6 mm。从重建结果可以看出肿瘤的轮廓和内部主要血管网络的形态和走向。实验结果表明,系统可以初步实现对小鼠肿瘤内部血管的结构成像,展示出系统在活体小动物肿瘤模型上的应用能力。

图 5. 小鼠肿瘤成像实物图

Fig. 5. Photo of mouse tumor imaging

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图 6. 小鼠肿瘤实验结果。(a)~(f)胰腺癌肿瘤的OPAM成像结果;(g)~(l)肝癌肿瘤的OPAM成像结果

Fig. 6. Experimental results of mouse tumors. (a)--(f) OPAM imaging results of pancreas tumors; (g)--(l) OPAM imaging results of liver tumors

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为在小动物结构成像基础上进一步分析胰腺癌肿瘤和肝癌肿瘤的特征,采用应用广泛的灰度共生矩阵(GLCM)分析方法来提取OPAM图像的纹理特征。GLCM的元素为将灰度级i的点按照某个固定距离d和角度θ移动至灰度级j的概率,记为p(i,j)。GLCM反映的是图像灰度关于方向、相邻间隔、变化幅度的综合信息。实验所获得的肿瘤OPAM图像原始灰度值分布范围较广,直接用于计算GLCM时运算量太大。为了降低运算量,对OPAM图像进行灰度等级划分,将GLCM的维数N×N设置为255×255。本文采用GLCM中常用的4个特征量来进行分析^[15]。

1) 能量(G_ASM),是指图像灰度值分布的均匀程度,当GLCM中主对角线元素分布集中时,G_ASM值较大,图像在局部区域的灰度分布较为均匀。其计算公式为

GASM=∑i=0N-1∑j=0N-1p2(i,j)。(1)

2) 熵(G_ENT),代表图像的信息量,可反映图像纹理特征的复杂程度,G_ENT值越大,表明图像纹理复杂度越高。计算公式为

GENT=-∑i=0N-1∑j=0N-1p(i,j)logp(i,j)。(2)

3) 对比度(G_CON),反映图像清晰度和纹理深度,G_CON值越大,表明图像清晰度越高,纹理越深。其公式为

GCON=∑n=0N-1n2∑i=0N-1∑j=0N-1p(i,j)。(3)

4) 相关性(G_CORR),反映GLCM中元素的差异性,即图像灰度在某一方向的变化程度。G_CORR值越大,表明元素差异性越小,图像灰度在该方向的变化趋势越不明显。其公式为

GCORR=∑i=0N-1∑j=0N-1ijp(i,j)-μxμyσxσy,(4)

式中:μ_x=∑i=0N-1ip(i,j);μ_y=∑j=0N-1jp(i,j);σ_x=∑i=0N-1(i-μx)2p(i,j);σ_y=∑j=0N-1(j-μy)2p(i,j)。本文在0°、45°、90°、135°这4个方向对每一张图像进行计算,得到4个GLCM,对这4个方向上的4个纹理特征值进行进一步计算,得到各个特征的均值。

图7所示为通过箱形图统计的两类肿瘤特征指标的分布趋势。由图7可知:胰腺癌肿瘤图像的G_ASM值大多高于肝癌肿瘤图像的G_ASM值,表明胰腺癌肿瘤图像灰度分布较为均匀;肝癌肿瘤图像的G_ENT值大多高于胰腺癌肿瘤图像的G_ENT值,表明肝癌肿瘤图像的复杂度高于胰腺癌肿瘤图像;与胰腺癌肿瘤图像相比,肝癌肿瘤图像的对比度大多较高,纹理较深;与肝癌肿瘤图像相比,胰腺癌肿瘤图像的G_CORR值较大,即图像灰度变化程度较小。基于以上分析,本研究的动物实验结果初步表明,肝癌肿瘤图像在纹理方面比胰腺癌肿瘤图像具有更明显的特征。采用双样本t检验方法^[16],对两类肿瘤4个指标的均值进行统计分析,特征参数G_ASM、G_ENT和G_CON的t检验对应的P值都小于0.05,G_CORR的t检验对应的P值小于0.01,说明两类肿瘤的4个特征参数差异均具有统计学意义。

图 7. 胰腺癌肿瘤和肝癌肿瘤的4个指标箱形图,采用双样本t检验方法计算P值,*为P<0.05,**为P<0.01。(a) G_ASM;(b) G_ENT;(c) G_CON;(d) G_CORR

Fig. 7. Box-and-whisker plots of four parameters for pancreas and liver tumors, where P values are calculated by two-sample t-test, *represents P<0.05, and **represents P<0.01. (a) G_ASM; (b) G_ENT; (c) G_CON; (d) G_CORR

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后续采用705 nm和800 nm两个波长进行双波长肿瘤实验,通过光谱解混方法^[17]获得肿瘤内部血氧饱和度信息。6例胰腺癌肿瘤的血氧饱和度值分别为60.87%、71.25%、67.01%、58.08%、68.54%和66.75%,6例肝癌肿瘤的血氧饱和度值分别为48.69%、54.86%、66.79%、41.03%、64.88%和62.84%。从以上数据得到的箱形图(图8)可以更加直观地看出,与肝癌肿瘤相比,胰腺癌肿瘤的血氧饱和度值略高,且变化范围较小。已有研究表明胰腺癌肿瘤与肝癌肿瘤均处于明显的乏氧状态^[18-19],本研究所获得的血氧饱和度信息说明了OPAM系统可以有效获取肿瘤内部的功能性信息。

图 8. 胰腺癌肿瘤和肝癌肿瘤的血氧饱和度指标箱形图

Fig. 8. Box-and-whisker plots of blood oxygen saturation values for pancreas and liver tumors

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5 结论

针对小动物肿瘤模型成像,采用高频聚焦超声探测器,并结合多角度全方位扫描策略,搭建了一套多角度全方位扫描的高灵敏度OPAM实验系统。通过仿体实验对系统性能进行了评估,结果显示该系统具备良好的分辨能力,小动物肿瘤模型实验结果进一步表明该系统可以获得高分辨的肿瘤结构图像。通过对6幅胰腺癌肿瘤OPAM图像和6幅肝癌肿瘤OPAM图像进行灰度特征分析,可初步发现肝癌肿瘤内部的纹理特征更为明显。由双样本t检验统计方法分析得出这两类肿瘤图像具有显著差异。最后采用双波长实验获得肿瘤的血氧饱和度值,表明该系统可有效获取两类肿瘤的功能性信息,为基于小动物肿瘤模型的肿瘤学研究提供了参考价值。

后续将开展大量的小鼠肿瘤实验,以进一步深入研究OPAM成像系统在辨别良恶性肿瘤、肿瘤类型以及肿瘤药物疗效评估等方面的应用潜力。在临床治疗前利用小动物肿瘤模型对靶向药物的有效性进行评价与筛选,有望提供更为直观可靠的精准治疗方案,以助于抗癌药物疗效监测等临床的基础研究。