1　引言

最近十几年，随着深加工食品在我国居民摄入食品中的不断增加，以结肠癌为主的消化道癌症逐渐成为我国发病率较高的重大疾病之一。传统手术和放化疗辅助的标准治疗模式往往无法长期抑制结肠癌的复发和转移，而且存在较强的副作用，迫切需要新的治疗方法和策略^［1］。激光光学疗法，包括光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT），通过时空特异性光照来定向诱导肿瘤细胞和组织内产生局域高热或活性氧簇分子，从而实现肿瘤的抑制或清除，已被证明是一种有前途的癌症治疗方法^［2］。近年来，近红外（NIR）激光介导的光学疗法因具有相对较高的组织光学穿透深度而逐渐成为肿瘤治疗的热点之一^［3-5］，特别是吲哚氰绿（ICG）介导的光学疗法。ICG具有近50年的临床使用安全记录，在近红外波段具有宽吸收，并且具有光热-光动力双重响应，因而受到广泛关注^［6］。ICG这种光敏药物经光照后会产生活性氧（ROS）等物种，这些活性氧物种不仅能高效地氧化生物分子，而且能与不饱和脂肪酸、蛋白质、核酸等反应，产生损伤效应，最终导致肿瘤细胞死亡^［7-8］。然而，ICG本身具有自聚集和自淬灭特点，并且其小分子在体内循环时间短，因而通常需要脂质体等载体来提高其分散稳定性同时帮助其在肿瘤组织中积聚，以便实现较好的光学治疗响应效率。但与传统的光敏或光热药物相比，ICG的光转换效率较低^［9-10］，因此其作为光学造影剂的效果远大于其作为光学治疗剂的效果^［11］。ICG介导的PTT效应温度通常低于50 ℃，同时，其自聚集的特点使其在光照下的ROS产率受到限制。这种温和的PTT/PDT不仅不能完全使肿瘤细胞坏死或凋亡，而且还会激活肿瘤细胞的热休克反应等抵抗机制，大大降低了治疗效果^［12］。因此，仅ICG介导的光学疗法不足以胜任癌症的治疗，尤其是无法用于治疗中晚期实体瘤。

免疫治疗，即通过激活或募集人体自身免疫系统清除肿瘤组织，已经在临床晚期肿瘤治疗方面显示出巨大潜力^［13］。此外，近期的研究表明，PDT和PTT可以诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD），从而可以进一步提高树突状细胞的成熟和免疫细胞的激活^［14］。因此，光-免疫协同疗法，即PDT/PTT与免疫疗法结合，应运而生。近年来，许多研究评估了基于ICG的光-免疫协同抗肿瘤作用^［15］。例如：谢晓燕课题组^［16］首次将脂质体ICG介导的PTT与PD-1、TIM-3免疫检查点抑制剂相结合，实现了对原发性肿瘤的清除以及对远处肿瘤的抑制；Jin课题组^［17］用含聚胞苷酸的热响应脂质体将ICG和水溶性免疫刺激分子聚肌苷酸同时包裹（含聚胞苷酸的热响应脂质体用于光热-免疫协同治疗），同样实现了对癌症生长和转移的抑制，同时提高了T细胞抗肿瘤免疫效果。除了免疫检查点抑制剂和免疫佐剂外，天然可食用物中的活性成分因具有对恶性肿瘤的显著抑制作用、较好的免疫促进作用和对人体相对较低的毒性也被逐渐用于光-免疫协同治疗的研究中^［18-19］。羽扇豆醇是一种广泛存在于水果、蔬菜皮、叶和茎皮中的天然五环三萜类化合物，已被证明具有较强的抗氧化、抗突变、抗炎效果^［20-21］。大量证据证明羽扇豆醇可以通过细胞信号通路途径诱导肿瘤细胞凋亡^［22］，并可以通过激活Ras、Fas和ERK等信号通路抑制肿瘤生长并促进自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞的增殖和活性^［23］。

基于此，笔者利用天然抗癌活性分子羽扇豆醇来提升NK细胞等免疫细胞的活性，将其与ICG介导的光学治疗结合，开发了基于纳米脂质体载药系统的NK细胞增强免疫疗法与PTT、PDT联合治疗的策略，以协同增强对结肠癌细胞的抑制效果。笔者以纳米脂质体为载体，将ICG和羽扇豆醇共同包封，制备了粒径均一、具有良好稳定性的纳米脂质体药物Lip-Lupeol & ICG。在808 nm激光两次间隔照射下，ICG介导的光热和光动力不仅可以诱导结肠癌细胞凋亡并引发免疫反应，还能释放包封的羽扇豆醇，从而激活NK细胞活性实现光-免疫协同抑癌作用，为结肠癌治疗提供了一种新思路。

2　实验材料与方法

2.1　结肠癌细胞和NK细胞的培养

将冻存的结肠癌细胞从-80 ℃冰箱中取出，置于37 ℃水浴锅中，不停地摇动直至冻存液融化。配制含12.5% FBS、100 μg/mL青霉素与100 μg/mL链霉素的F-12K完全培养基。冻存液融化后进行细胞离心，弃去冻存液，加入1 mL完全培养基，将细胞移至培养皿中，再加入完全培养基补足至10 mL；将培养皿置于5% CO₂细胞培养箱中，在37 ℃条件下培养24 h，换液时将原培养基弃去，再加入2 mL PBS溶液轻微摇晃润洗后弃去上清液。

将冻存的NK细胞从-80 ℃冰箱中取出，置于37 ℃水浴锅中，不停地摇动直至冻存液融化。配制含0.2 mmol/L肌醇、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.02 mmol/L叶酸、12.5%马血清和12.5% FBS的MEMα完全培养基。冻存液融化后进行细胞离心，弃去冻存液，加入1 mL完全培养基，将细胞移至细胞培养瓶中，再加入完全培养基补足至6 mL；将培养瓶置于5% CO₂细胞培养箱中，在37 ℃下培养24 h。

2.2　不同浓度羽扇豆醇对结肠癌细胞和NK细胞活性的影响评估

将对数生长期的结肠癌细胞均匀铺于96孔板中，每孔加100 μL细胞悬液，每孔中的细胞数量为1×10⁴个。将96孔板置于5% CO₂细胞培养箱中并于37 ℃过夜，弃去孔板中的原培养基，向每孔中分别加入含有不同浓度羽扇豆醇的完全培养基溶液100 μL，继续培养24 h，保留原培养基，向每孔中分别加入CCK-8溶液10 μL后继续培养。根据试剂说明书采用酶标仪检测结肠癌细胞在450 nm下的吸光度。NK细胞的培养同上述步骤。

2.3　羽扇豆醇对NK细胞IFN‑γ表达的影响

将对数生长期的NK细胞均匀铺于24孔板中，每孔中的细胞数量为1×10⁵个，培养15 h。弃去孔板中的原培养基，向每孔中分别加入含有不同浓度羽扇豆醇的完全培养基混合溶液500 μL，继续培养24 h。对处理后的NK细胞进行离心，吸取上清液，将其加入50 μL待测样品中，再与相对应的IFN-γ Elisa试剂盒溶液混合，15 min后检测450 nm波长下每孔的光密度（OD）值。

2.4　羽扇豆醇对结肠癌细胞表面NKG2D受体表达的影响

用Western Blot检测羽扇豆醇对结肠癌细胞表面NKG2D受体（包括MICA、ULBP-2蛋白）表达的影响。首先将对数生长期的结肠癌细胞均匀铺于6孔板中过夜，然后加入不同浓度的羽扇豆醇进行处理；将细胞原有培养基弃去，加入PBS缓冲液清洗两次，接着加入细胞裂解液200 μL，静置10 min，再用细胞刮刀刮取细胞，收集细胞蛋白样本至离心管内，进行离心。取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；将调平后的20 μg蛋白样品加在丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后将样品转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上；室温下，将PVDF膜放入5%封闭液中孵育70 min，接着将PVDF膜与兔抗人单克隆抗体MICA、ULBP-2置于4 ℃摇床上过夜，β-actin作为内参蛋白；用TBST洗PVDF膜3~5次，每次8 min，接着将PVDF膜与二抗孵育70 min，再用TBST洗膜（与上述步骤相同）。最后将膜与化学发光试剂盒的底物孵育，显影发光，用ImageJ计算灰度值。

2.5　羽扇豆醇对NK细胞介导的抗肿瘤活性的影响

将对数生长期的NK细胞均匀铺于24孔板中，每孔中的细胞数量为1×10⁵个。培养15 h后，弃去孔板中的原培养基，向每孔中分别加入含有不同浓度羽扇豆醇的培养基溶液500 μL，继续培养24 h；然后使用乳酸脱氢酶（LDH）释放测定法测定NK细胞介导的细胞毒性，用完全培养基将收集的结肠癌细胞密度调至1×10⁵ mL^-1。同样计数NK细胞，并根据制定的效靶比（4∶1）调节NK细胞的密度。将结肠癌细胞和NK细胞各100 μL加入96孔板中并混合均匀，同时设置结肠癌细胞最大释放组（加入LDH释放试剂）和结肠癌细胞自然释放对照组。孵育4 h后用多孔板离心机以2000 r/min的速度离心5 min，取100 μL上清液并将其转移到新的96孔板中。使用LDH细胞毒性检测试剂盒根据说明书检测上清液中释放的LDH。

2.6　羽扇豆醇脂质体（Lip‑Lupeol）、ICG脂质体（Lip‑ICG）和复合脂质体（Lip‑Lupeol&ICG）的合成

使用薄膜分散和物理挤出法制备纳米脂质体：1）按1∶1∶2.5∶5的质量比（总质量为16.5 mg）称取DPPC、DOTAP、DSPE-PEG2000、胆固醇并用氯仿溶解，羽扇豆醇用丙酮溶解（40 μg/mL）；2）向玻璃试管中加入400 μL DPPC、200 μL DOTAP、200 μL DSPE-PEG2000、50 μL胆固醇和40 μL羽扇豆醇溶液（ICG脂质体中不加入），用涡旋振荡器缓慢但充分振荡或者用移液枪吹打混匀，然后用氮气吹干并使其在试管壁上形成一层均匀的脂质体薄膜，真空干燥10 h；3）加入400 μL 1000 μg/mL ICG水溶液（羽扇豆醇脂质体不加入），在49 ℃水浴锅中水浴20 min，随后用孔径为100 nm的聚碳酸酯膜和小型脂质体挤压系统进行多次挤压，获得粒径均一的ICG脂质体、羽扇豆醇脂质体以及同时包封ICG和羽扇豆醇的脂质体；4）使用凝胶色谱柱除去游离的药物，重新收集脂质体。

采用低温透射电子显微镜（Cryo-TEM）对脂质体的形态进行表征，使用动态光散射仪（DLS）对脂质体的粒径和Zeta电位分别进行测量。脂质体中ICG的包封率通过ICG的荧光强度进行评估，羽扇豆醇的包封率间接通过上清液中羽扇豆醇的残留量进行评估。

2.7　体外光热表征及光热响应的药物释放

ICG介导的光热效应导致的局部升温会使脂质体破裂，故而用808 nm激光分别照射F-12K完全培养基、空白脂质体（Blank）、Lip-Lupeol、Lip-ICG，照射时间分别为2、4、6、8、10、12、14、16 min，测量其在各时间点的温度变化。准备96孔板，4个孔为一组，从左到右从上到下分别是Lip-ICG、Lip-Lupeol、Blank、PBS，用红外热像仪分别在0、10、20 min时拍摄红外热成像照片。观察ICG介导的PTT能否达到脂质体的相转变温度从而破裂释放药物。另外，为了评估Lip-Lupeol & ICG的体外响应特性，采用透析法分析PTT触发的脂质体ICG的释放效率。简而言之，将3 mL Lip-Lupeol & ICG溶液加入截留值为100000 Da（1 Da=1 u）的透析袋（Float-A-Lyser，Spectrum Labs）中，将透析袋置于含有2 L PBS的透析装置中，在37 ℃下持续透析48 h。透析开始后2 h，使用808 nm激光对溶液进行20 min的辐照（200 mW/cm²）。在不同时间点取样，使用荧光光谱仪测量不同时间点透析袋中残留的ICG的浓度。

2.8　结肠癌细胞对Lip‑Lupeol & ICG的内吞作用

将结肠癌细胞以1×10⁵ mL^-1的密度接种在24孔板中，加入Lip-Lupeol & ICG共同孵育，然后分别在不同的时间点（2 h、4 h和6 h）收集细胞进行荧光光谱分析（激发波长E_x=808 nm，发射波长E_m=810 nm）。采用共聚焦显微镜表征Lip-Lupeol & ICG在细胞中的分布：先将结肠癌细胞接种在共聚焦培养皿中，贴壁后再加入Lip-Lupeol & ICG孵育4 h；然后加入4%多聚甲醛室温固定30 min，再用PBS洗涤细胞，然后用4’，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色5 min；最后采用共聚焦显微镜观察细胞并拍照。用流式细胞仪测量荧光强度，测量前，将结肠癌细胞以1×10⁵ mL^-1的密度接种，第二天加入Lip-Lupeol & ICG分别孵育2、4、6 h，收集细胞，避光处理。

2.9　Lip‑Lupeol & ICG复合脂质体光照后ROS的产生

Lip-Lupeol & ICG复合脂质体光照后，由于ICG的光动力作用会产生活性氧簇分子ROS，因而可以诱导结肠癌细胞凋亡。使用活性氧荧光探针DCFH-DA检测结肠癌细胞中ROS是否产生。将1×10⁵个结肠癌细胞接种到共聚焦专用培养皿中，分别与1 μg/mL Lip-ICG（含有1 μg/mL ICG）共同孵育4 h，未经处理的细胞作为阴性对照组。用PBS洗涤细胞，加入无血清培养基稀释的DCFH-DA探针（终浓度为10 μmol/L），继续培养20 min，PBS洗涤细胞后用808 nm激光辐照（200 mW/cm²）5 min。采用荧光显微镜（在FITC通道下）观察荧光图像（E_x/E_m=495 nm/520 nm）并用荧光显微镜拍照。

2.10　Lip‑Lupeol & ICG复合脂质体对结肠癌细胞活性抑制效果的评估

使用CCK-8法评估Lip-Lupeol & ICG复合脂质体对结肠癌细胞活性的抑制效果。将结肠癌细胞接种在96孔板中，并用含不同浓度Lip-Lupeol、Lip-ICG、Lip-Lupeol & ICG以及Blank的F-12K完全培养基（体积比1∶1，即50 μL脂质体+50 μL完全培养基）共孵育4 h。将细胞分为4组：1）用808 nm激光辐照20 min（200 mW/cm²）；2）先辐照20 min（200 mW/cm²），间隔20 min后再辐照10 min（200 mW/cm²），继续培养24 h；3）加入NK细胞，先辐照20 min（200 mW/cm²），间隔20 min后再辐照10 min（200 mW/cm²）；4）不辐照，培养24 h。各孔加入1% CCK-8孵育2 h后测量450 nm下的吸光度值，计算细胞存活率。

2.11　统计学分析

使用GraphPad Prism 9对实验结果进行统计分析，结果表示为平均值±标准偏差（SD）。使用单因素方差分析进行多组之间的比较。统计显著性定义为P<0.05（*）、P<0.01（**）和P<0.001（***）。

3　实验结果与讨论

3.1　羽扇豆醇对肿瘤细胞和NK细胞活性的影响

大量的研究已证明羽扇豆醇可显著抑制肿瘤细胞的活性，为了后续研究其与ICG介导光学疗法的协同效果，需要首先阐明羽扇豆醇对肿瘤细胞和NK细胞活性的影响。图1（a）显示了不同质量浓度的羽扇豆醇对结肠癌细胞活性（采用CCK-8法检测结肠癌细胞的活性）的影响。随着质量浓度增大，羽扇豆醇对细胞的杀伤能力逐渐增强：20 μg/mL羽扇豆醇可使结肠癌细胞活力出现轻微下降（91.12%），当其质量浓度达到30 μg/mL时，结肠癌细胞活性降低至72.2%，继续增加羽扇豆醇质量浓度至40 μg/mL时，结肠癌细胞的活性降低至54.3%。这一结果说明羽扇豆醇作为天然抗癌活性分子在达到一定质量浓度时能够显著抑制结肠癌细胞增殖。图1（b）显示了不同质量浓度的羽扇豆醇对NK细胞活性的影响，可见：当羽扇豆醇质量浓度小于20 μg/mL时，NK细胞的活性相比对照组没有显著增加；当羽扇豆醇质量浓度增加至30 μg/mL时，NK细胞的活性有了显著性提高；当羽扇豆醇的质量浓度增加至40 μg/mL时，NK细胞的活性变低。可见，质量浓度在30 μg/mL左右的羽扇豆醇能够显著提升NK细胞的活性，验证了其对免疫细胞活性的提升作用。

图 1. 羽扇豆醇对结肠癌细胞和NK细胞的影响。（a）不同质量浓度的羽扇豆醇对结肠癌细胞的毒性；（b）不同质量浓度的羽扇豆醇对NK细胞活性的影响；（c）经不同质量浓度的羽扇豆醇处理的NK细胞对结肠癌细胞的杀伤作用；（d）不同质量浓度的羽扇豆醇对NK细胞IFN-γ表达的影响；（e）（f）不同质量浓度的羽扇豆醇对结肠癌细胞表面MICA、ULBP-2表达的影响

Fig. 1. Effects of lupeol on colon cancer cells and NK cells. (a) Toxicity of different mass concentrations of lupeol on colon cancer cells; (b) effect of different mass concentrations of lupeol on NK cell activity; (c) killing effect of NK cells treated with different mass concentrations lupeol on colon cancer cells ; (d) effect of different mass concentrations of lupeol on the expression of IFN-γ in NK cells;(e)(f) effect of different mass concentrations of lupeol on the expression of MICA and ULBP-2 on the surface of colon cancer cells

下载图片 查看所有图片

进一步评估了不同质量浓度羽扇豆醇处理后的NK细胞对结肠癌细胞的抑制效果，结果如图1（c）所示。NK细胞是淋巴细胞中主要起免疫作用的细胞，可以通过NKG2D配体蛋白更容易地识别、杀伤结肠癌细胞，但通常情况下结肠癌组织可以通过抑制NK细胞的IFN-γ干扰素表达或水解表面的NKG2D配体蛋白，使NK细胞活性降低或不能识别肿瘤细胞。因此，未经羽扇豆醇处理的NK细胞仅能对结肠癌细胞造成24.35%的活性抑制，而采用30 μg/mL羽扇豆醇处理的NK细胞对结肠癌细胞的抑制效果可显著增加到45.35%，并且随着羽扇豆醇质量浓度增加，NK细胞对结肠癌细胞的抑制效果显著提升。当羽扇豆醇的质量浓度为40 μg/mL时，其可对结肠癌细胞造成52.25%的活性抑制。可见，一定质量浓度的羽扇豆醇可以显著增加NK细胞的抗肿瘤免疫活性，这为后续研究其与ICG介导的光学协同疗法奠定了基础。

3.2　羽扇豆醇对NK细胞免疫作用提升机理的研究

在明确羽扇豆醇可以提升NK细胞活性和增强抗肿瘤效果以后，笔者进一步研究了其作用机理。羽扇豆醇对NK细胞活性的影响主要反映在NK细胞IFN-γ干扰素表达和肿瘤细胞表面NKG2D配体蛋白表达两方面。如图1（d）所示，对经不同质量浓度羽扇豆醇处理的NK细胞IFN-γ干扰素的表达进行分析可以发现：与未经处理的对照组相比，经5、10 μg/mL羽扇豆醇处理的NK细胞的IFN-γ干扰素的质量浓度基本没有发生变化；但当羽扇豆醇质量浓度上升到20 μg/mL和30 μg/mL时，IFN-γ干扰素质量浓度分别达到了57.8 pg/mL和83.23 pg/mL。可见，羽扇豆醇可以通过促进NK细胞IFN-γ的表达增强其活性和抗肿瘤作用。

此外，肿瘤细胞表面产生的NKG2D配体使NK细胞更容易识别之并对之进行杀伤，因此笔者还检测了不同质量浓度羽扇豆醇处理后的结肠癌细胞上NKG2D配体（MICA和ULBP-2）表达的变化。如图1（e）、（f）所示，随着羽扇豆醇质量浓度增大，培养24 h后，结肠癌细胞表面MICA和ULBP-2均有表达，但表达量没有明显变化。这说明羽扇豆醇不能通过促进肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达来增强NK细胞的抗肿瘤作用。

3.3　Lip‑Lupeol、Lip‑ICG、Lip‑Lupeol & ICG的表征

如图2（a）所示，使用冷冻透射电镜Cryo-TEM对所制备的脂质体结构和外观进行表征。所制备的脂质体（Blank：不包封任何药物；Lip-Lupeol：只包封羽扇豆醇；Lip-ICG：只包封ICG；Lip-Lupeol & ICG：共包封羽扇豆醇和ICG）呈球形，形态规则均一，有明显的磷脂双分子层结构，并且都呈现为单层或双层囊泡，有利于其中ICG和羽扇豆醇药物的包封和释放。此外，脂质体分散性良好，没有观察到聚集现象。

图 2. ICG和羽扇豆醇脂质体及其复合脂质体的表征。（a）冷冻电镜表征结果；（b）粒径分布表征结果；（c）Zeta电位表征结果；（d）稳定性表征结果；（e）脂质体紫外吸收光谱图；（f）脂质体中羽扇豆醇的高效液相色谱图

Fig. 2. Characterization of ICG and lupeol liposomes and their composite liposomes. (a) Freezing electron microscopy characterization results; (b) characterization results of particle size distribution; (c) Zeta potential characterization results; (d) stability characterization results; (e) UV absorption spectra of liposomes; (f) high performance liquid chromatography of lupeol in liposomes

下载图片 查看所有图片

同时，使用马尔文粒度仪对所制备的脂质体的粒径和电位进行表征。如图2（b）所示，所制备脂质体的粒径大部分集中在150 nm左右处，且粒径分布范围较窄，聚合物分散性指数（PDI）约为0.05，而且ICG和羽扇豆醇的封装不会对脂质体粒径产生较大影响。如图2（c）所示，4种不同脂质体均带有一定的正电荷，可以更容易地被肿瘤细胞摄取。这一特点结合脂质体表面PEG支链的空间位阻效应，使得脂质体具有较好的稳定性。如图2（d）所示，在4 ℃保存14 d后，所有脂质体的粒径都没有发生明显变化，PDI也没有发生改变，说明所制备的脂质体可以保存较长时间，证实了其具有良好的分散性和稳定性。

进一步地，笔者测定了不同脂质体的紫外吸收光谱图，如图2（e）所示。可见，ICG脂质体和复合脂质体在600~800 nm范围内都有较宽的吸收，而且在800 nm左右处的吸收最强。同时，根据不同质量浓度ICG溶液的吸收光谱，计算得到了ICG脂质体和复合脂质体中ICG的包封率分别为46.01%和29.2%。图2（f）显示了羽扇豆醇脂质体和复合脂质体的高效液相色谱图，根据不同质量浓度羽扇豆醇的峰面积可以计算得到羽扇豆醇脂质体和复合脂质体中羽扇豆醇的包封率分别为77.03%和42.1%。可见，制备得到的复合脂质体可以同时较好地负载一定质量浓度的ICG和羽扇豆醇，这为后期研究中药物剂量的定量提供了参考。

3.4　Lip‑Lupeol & ICG的光热性能表征及其诱导的药物释放

Lip-Lupeol & ICG在808 nm激光照射下具备较好的光热性能，这是因为ICG聚集嵌入磷脂双层膜中。图3（a）表明，不包封ICG的脂质体不会因为激光照射而在短时间内剧烈升温，但是包封ICG的脂质体在0~8 min内快速升温，照射8 min时温度可升至42.2 ℃，之后随着照射时间延长，温度趋于稳定。这是因为磷脂分子在高温下的相变特性使得温度升高后脂质体结构破裂。由图3（b）可见，ICG的光热效应使磷脂双分子层脂质中的温度升高达到其临界相变温度（42 ℃），脂质体结构破裂，变成了外形大小不均一的形态，从而达到了释放药物的目的。图3（c）显示的是不同脂质体以及PBS经808 nm激光（200 mW/cm²）照射后不同时间（0、10、20 min）时的红外热成像图，左上角包封ICG的脂质体随着时间延长，越来越亮，表明其局部温度越来越高。图3（d）表明，经808 nm激光照射的Blank和包封羽扇豆醇的脂质体释放缓慢，包封羽扇豆醇的脂质体在透析20 min后大约只有16.9%的羽扇豆醇从脂质体中释放出来，且在0~20 min内释放率没有显著升高。然而，当用激光刺激包封ICG的脂质体后，前10 min内羽扇豆醇释放量没有较大变化，但是在10 min时，羽扇豆醇的释放量开始急剧增加，并在18 min左右时达到82.1%。这说明Lip-Lupeol & ICG中ICG的光热效应有助于实现时空特异的药物释放。

图 3. Lip-Lupeol & ICG的光热性能表征以及光热诱导的药物释放。（a）不同脂质体在光照后的温度变化；（b）冷冻电镜显示光照后复合脂质体破裂；（c）不同脂质体在光照不同时间后的红外热成像图展示了温度变化；（d）光照后不同脂质体的ICG释放量

Fig. 3. Characterization of photothermal properties and photothermal induced drug release of Lip-Lupeol & ICG. (a) Temperature changes of different liposomes after light exposure; (b) freeze electron microscopy shows the rupture of the composite liposome after light exposure; (c) temperature changes shown by infrared thermal imaging images of different liposomes after different light exposure time; (d) ICG release of different liposomes after light exposure

下载图片 查看所有图片

3.5　Lip‑Lupeol & ICG的结肠癌细胞内吞和细胞内ROS生成

为了确定细胞对Lip-Lupeol & ICG的摄取效率，使用荧光分光光度计法检测了结肠癌细胞与Lip-Lupeol & ICG共孵育2、4、6 h后细胞所含ICG的荧光强度。如图4（a）所示，共孵育2 h后，细胞内能够检测到ICG的荧光强度，并且在2~4 h内可检测到荧光强度显著升高，共孵育4 h后达到 最大荧光强度。共孵育6 h后，荧光强度略微降低（与共孵育4 h相比），这可能是由于细胞对脂质体的摄取在4 h时达到平衡。图4（b）显示了孵育4 h后结肠癌细胞中ICG荧光的分布，图内蓝色是因为使用Dapi对细胞核进行了染色，红色代表ICG的分布。由于ICG具有两亲性，因此其主要分布在细胞膜上。图4（c）所示流式细胞的结果也表明结肠癌细胞与ICG脂质体、复合脂质体共孵育4 h后荧光强度达到最大。这些结果说明了结肠癌细胞能够有效摄取Lip-Lupeol & ICG，并在共孵育4 h后达到内吞峰值。

图 4. Lip-Lupeol & ICG对结肠癌细胞的作用效果。（a）荧光分光光度计检测结肠癌细胞对Lip-Lupeol & ICG的内吞作用；（b）激光共聚焦显微镜显示内吞后ICG在结肠癌细胞内的分布；（c）流式细胞仪检测结肠癌细胞对Lip-Lupeol & ICG的内吞作用；（d）不同光照模式下，Lip-Lupeol & ICG在结肠癌细胞内的ROS生成情况；（e）Lip-Lupeol & ICG对结肠癌细胞的光热-光动力抑制效果及其结合NK细胞对结肠癌细胞的光-免疫协同抑制效果

Fig. 4. Effect of Lip-Lupeol & ICG on colon cancer cells. (a) Fluorescence spectrophotometer detection of the endocytosis of Lip-Lupeol & ICG by colon cancer cells; (b) laser confocal microscopy shows the distribution of ICG in colon cancer cells after endocytosis; (c) flow cytometry detection of the endocytosis of Lip-Lupeol & ICG by colon cancer cells; (d) ROS production of Lip-Lupeol & ICG in colon cancer cells under different light modes; (e) Lip-Lupeol & ICG’s photothermal photodynamic inhibition effect on colon cancer cells and its photoimmune synergistic inhibition effect combined with NK cells on colon cancer cells

下载图片 查看所有图片

Lip-Lupeol & ICG在光照引发的光热作用下释放后，ICG在细胞内扩散游离，再次进行光照可以有效诱导其进一步的PDT作用。为了验证这一点，笔者用ROS特异性探针DCFH-DA检测了不同光照情况下Lip-Lupeol & ICG在细胞内的ROS生成情况。图4（d）显示：经808 nm激光辐照后，未经处理和未经光照的结肠癌细胞组生成的ROS极少，仅进行一次20 min光照处理后，结肠癌细胞中仅有少量的ROS。这是因为在一次照射后，ICG主要积聚在脂质体膜中，而团簇效应在光照下主要发挥光热效应，光动力效应较弱。经过两次间隔20 min光照的细胞中产生的ROS水平显著高于只进行一次光照的ROS水平，这是因为在第一次光照诱导的光热作用后，ICG从脂质体中释放到细胞质中，在20 min间隔期间，释放的ICG主要处于游离状态，此时进行第二次光照能够更好地发挥其光动力效应，产生更多的ROS。因此，利用ICG脂质体的这种两步间隔光照，还可以最大化协同结合光热和光动力的光学治疗效果。

3.6　Lip‑Lupeol & ICG对结肠癌细胞的抑制效果

图4（e）显示了纳米脂质体对结肠癌细胞的PTT/PDT以及光-免疫协同抑制效果。在没有激光照射的情况下，Blank对结肠癌细胞无明显的细胞毒性，细胞活力基本上与对照组保持一致，说明Blank具有良好的生物相容性。在仅进行一次20 min光照组中，Blank与Lip-Lupeol处理的细胞的活性没有明显变化，但由于ICG的光热作用，Lip-ICG和Lip-Lupeol & ICG使得细胞活性分别下降至64%和59.6%。由于复合脂质体Lip-Lupeol & ICG中羽扇豆醇的质量浓度不高，对结肠癌细胞的直接抑制作用有限，故而光热释放后Lip-Lupeol & ICG和Lip-ICG处理的细胞的活性抑制程度区别不大。但在两步间隔光照组中，由于进一步释放后ICG的光动力效应被激活，Lip-ICG和Lip-Lupeol & ICG使得细胞活性分别进一步下降至54.1%和43.4%。可见，两步间隔光照模式能够最大化发挥复合纳米脂质体的光学抑癌效果。为了明确复合脂质体中羽扇豆醇的协同作用，在两步间隔光照的基础上进一步加入了NK细胞的作用。可以看到，随着NK细胞的加入，Lip-Lupeol、Lip-ICG、Lip-Lupeol & ICG 处理的细胞的活性都显著低于仅进行光照组。同时，对比该组中Lip-ICG和Lip-Lupeol & ICG处理的细胞可以看到两者具有明显的活性差异，复合脂质体处理的细胞释放的羽扇豆醇显著增强了NK细胞的作用效果，最终能够将结肠癌细胞的活性抑制到16.7%，从而证明了低剂量羽扇豆醇不会直接抑制肿瘤细胞活性，但能够协同NK细胞与ICG光学治疗达到明显增强的光-免疫协同作用效果。

综上所述，本研究证明了羽扇豆醇对NK细胞的免疫增强机制和效果，以及其通过复合纳米脂质体载体与ICG介导的PTT/PDT协同的光-免疫增强治疗作用。研究中采用的ICG、羽扇豆醇天然分子和脂质体纳米载体，都容易进行临床转化，这些都有利于笔者所构建的羽扇豆醇和ICG复合纳米脂质体的进一步动物实验研究和临床实际转化，相信对其进行进一步研究可促进其在结肠癌治疗中的应用。

4　结论

本文验证了羽扇豆醇天然分子对NK细胞活性提升的效果和作用机理。笔者设计合成了一种能同时包封ICG和羽扇豆醇的复合纳米脂质体（Lip-Lupeol & ICG），实现了ICG诱导的近红外光热/光动力作用联合羽扇豆醇介导的NK细胞增强免疫疗法对结肠癌细胞的光-免疫协同抑制作用。研究结果表明，当采用30 μg/mL的羽扇豆醇处理NK细胞后，NK细胞无明显损伤，且分泌的IFN-γ由对照组的38.97 pg/mL上升到了83.23 pg/mL，对结肠癌细胞的抑制效果由24.35%显著提升到45.35%。可见，适当质量浓度的羽扇豆醇可以显著增加NK细胞的抗肿瘤作用。进一步，将羽扇豆醇与ICG通过脂质体载体整合制备的复合脂质体Lip-Lupeol & ICG能够有效包封羽扇豆醇和ICG，且粒径均一（集中分布在150 nm附近），分散性良好（PDI约为0.05），能够有效被结肠癌细胞摄取。复合脂质体中ICG和羽扇豆醇的包封率分别达到了29.2%和42.1%。采用808 nm激光以200 mW/cm²照射20 min后，包封在其中的药物能够通过ICG诱导的光热升温作用快速释放，光热作用可使结肠癌细胞活性下降至59.6%。间隔10 min后继续照射10 min这种方式利用释放游离ICG的光动力作用可使结肠癌细胞活性进一步降低至43.4%，在该方式的基础上加入NK细胞后，由于释放的羽扇豆醇对NK细胞活性的增强作用，可将结肠癌细胞活性进一步降至16.7%。可见，Lip-Lupeol & ICG在发挥ICG光学疗法作用的同时可以协同羽扇豆醇结合NK细胞过继疗法实现光-免疫协同增强的结肠癌细胞抑制效果。

目前，笔者仅对Lip-Lupeol & ICG的体外结肠癌细胞抑制进行了部分研究，光学疗法对NK细胞作用的影响以及在体研究将在后续进行，但目前的这些研究结果已经证明基于ICG脂质体的光学治疗可以有效地与羽扇豆醇等天然免疫活性分子的免疫增强作用结合实现较好的光-免疫协同作用，这可为相关药物的临床转化以及开发新的肿瘤光学和免疫治疗提供新思路。