双光子荧光（two-photon fluorescence，TPF）显微成像技术借助荧光探针实现样品中被标记成分的特异性成像，具有天然的三维层析能力、高成像深度与空间分辨率、以及更小的光漂白与光损伤，已经发展成为化学、医药学和生命科学领域的一项重要研究工具。文中通过分析高斯光束复振幅在空间中的分布，推导出TPF信号的纵向与径向分布公式，以此估算出文中的TPF显微成像系统的横向分辨率为453 nm，纵向分辨率为2.087 μm。使用飞秒激光器作为激发光源，搭建了TPF显微成像系统。在800 nm波长的飞秒脉冲激发下，测量了罗丹明B溶液的TPF光谱，从而选择636~703 nm作为显微成像的荧光探测窗口。随后开展了对罗丹明B染色的小鼠大脑切片的TPF显微成像实验研究，利用断层扫描成像的方式获得了小鼠大脑切片在0~14 μm深度内的荧光强度分布。通过三维重构完成了对生物样品的三维立体成像，获得了小鼠大脑中灰质与白质在不同深度的分布情况，实验结果证明了搭建的显微成像系统具有优异的成像深度与空间分辨能力。