封面 | 有机近红外二区荧光探针

封面解读：封面展示了从多种属性如荧光量子效率（QE）、摩尔吸光系数（ε）、吸收/发射波长（λ_abs/λ_em）、生物相容性（BC）、光稳定性（PS）等方面提高有机近红外二区（NIR-Ⅱ）荧光探针性能的过程，以《斗破苍穹》主角萧炎的成名绝技“佛怒火莲”为背景，每增强一种属性代表融合一种“异火”，最终形成“佛怒火莲”般的强大威力，进而全面提升有机NIR-Ⅱ荧光探针的性能。

原文链接：刘嘉慧，杨燕青，马睿，施可彬. 有机近红外二区荧光探针研究进展[J]. 中国激光, 2023, 50(21): 2107101

与可见光区（400~700 nm）和近红外一区（NIR-I，700~900 nm）荧光成像（FL）相比，近红外二区（NIR-II，1000~1700 nm）荧光成像具有更深的穿透深度和更高的信噪比。开发亮度高、吸收/发射波长长、生物相容性好的NIR-II荧光探针一直是NIR-II荧光成像领域的一个重要研究方向。自从单壁碳纳米管（SWNTs）首次被应用于小动物活体NIR-II荧光成像以来，开发具有高摩尔吸光系数、高荧光量子产率、稳定性好、生物相容性好的NIR-II荧光探针成为NIR-II荧光领域的研究热点。目前，NIR-II荧光探针主要分为有机材料和无机材料两大类。以单壁碳纳米管、量子点、稀土掺杂下转换材料为代表的NIR-II无机荧光探针具有生物相容性较差、无法在体内完成生理代谢、重金属毒性较强等弊端，严重制约了其在临床实践中的应用。以D-A-D有机小分子、花菁类染料、共轭聚合物等为代表的有机NIR-II荧光探针具有结构明确、生物相容性好、无重金属离子毒性等优点，在临床实践上具有更广阔的应用前景。

本文总结了目前文献报道的有机NIR-II荧光探针的分子结构设计理念和生物医学成像应用。下面将按照花菁类染料、D-A-D小分子和共轭聚合物的分类方式分别介绍有机NIR-II荧光探针的研究进展。

1、花菁类染料

自1856年Williams用喹啉和戊基碘反应首次制备得到花菁类染料以来，花菁类染料以其高摩尔消光系数（>100000 L·mol^-1·cm^-1）、高荧光量子产率等优点备受青睐，已被广泛应用于生物成像。该类荧光分子中间为甲川基(CH)n组成的共轭链，共轭链与两端含有氮/硫/氧的杂环构成一个大共轭体系。在过去的几十年中，已经有许多具有长波长吸收或发射的花菁类染料被开发研制出来，但由于成像系统的限制，这些花菁类染料没有得到进一步应用和研究。随着NIR-II荧光成像系统的迅猛发展，花菁类染料因具有多种固有优势而在生物医学应用中开始受到越来越多的关注。研究表明，适用于高速、高灵敏、超分辨NIR-II荧光成像的花菁类染料具有以下三个优点：1）具有长波长的吸收和荧光发射；2）在生物体内具有较高的 NIR-II 荧光亮度；3）优异的生物相容性和稳定性。

1.1 吸收/发射波长红移策略

激发波长的红移有利于增大穿透深度和提高成像分辨率。目前，实现花菁类染料吸收/发射波长红移的策略主要可以分为以下三类：1）延长有效共轭长度；2）修饰推拉电子体系，如杂原子替换（硫原子置换氧原子）、增强供体单元的供电子能力、杂环改造等；3）构建J-聚体。

甲川基共轭链是决定花菁类染料光谱性质的主要结构因素，增加甲川基的个数可以有效延长荧光分子的有效共轭长度，进而使其吸收波长和荧光发射波长红移。然而，由于“菁极限”的限制，当甲川基数量超过一定数目时，分子的光稳定性和荧光量子产率将急剧下降。值得指出的是，两端的杂环结构也会对荧光分子的光谱性质产生显著影响。因此，可以通过对两端杂环进行合理修饰来获得具有长波长吸收/发射的探针。2017年，Bawendi团队通过延长分子的有效共轭长度和增强两端杂环的推电子能力实现了吸收和发射波长的红移（吸收波长可从650 nm红移至1026 nm，发射波长从680 nm红移至1045 nm）。图1给出了设计长发射波长荧光探针的代表性策略。

图1 设计具有长发射波长荧光探针的代表性策略。（a）延长共轭长度；（b）杂原子替换；（c）供体单元改造；（d）杂环替代；（e）构建J-聚体

1.2 荧光量子产率提升策略

提升探针亮度有助于提高成像信噪比。荧光探针吸收/发射波长的红移势必会导致荧光量子效率的降低。与NIR-I区荧光分子相比，NIR-II荧光分子的亮度几乎下降了两个数量级。目前，文献报道的提升NIR-II花菁类染料荧光亮度的策略主要可以分为以下三类：1）引入空间位阻；2）与蛋白形成复合物；3）增强分子结构的刚性，如图2所示。

图2 提高荧光亮度的代表性策略。（a）引入空间位阻；（b）与蛋白质进行自组装；（c）提高分子结构的刚性

1.3 生物相容性和稳定性提升策略

NIR-II花菁类染料往往具有较差的水溶性，难以直接应用于活体成像。目前，提高NIR-II花菁类染料生物相容性的策略主要可以分为以下两大类：1）通过纳米沉淀法利用两亲性材料包覆疏水荧光分子；2）通过分子工程手段在疏水荧光分子上引入亲水基团。

2、D-A-D有机小分子

D-A-D有机小分子具有化学结构清晰、光学性能可调、代谢特性优异、生物相容性良好等优点，是有机NIR-II荧光探针研究的一大热点。如图3所示，戴宏杰团队首次报道了一种可用于NIR-II荧光成像的水溶性小分子CH1055-PEG。CH1055-PEG的最大吸收峰位于750 nm，最大发射峰位于1055 nm，荧光量子产率约为0.3%。在识别淋巴管系统及肿瘤附近的前哨淋巴结时，CH1055-PEG表现出了远优于NIR-I荧光染料ICG的成像性能，这也是开发可快速代谢有机NIR-II荧光探针的先驱工作。随后，CH1055分子骨架的侧链上被引入靶向单元，并被应用于FTC-133甲状腺肿瘤检测、整合素靶向U87MG肿瘤成像并指引手术切除、膝关节软骨退变成像和骨关节炎检测、生殖腺和骨骼中的卵泡刺激素受体进行实时成像等。

图3 CH1055 的物理属性及其生物应用

2.1 供体/受体单元调控

有机NIR-II荧光探针的光致发光机制主要依赖于分子内电荷转移（ICT）过程。当荧光探针被从基态被激发到激发态时，电子将从供体转移到受体形成电荷分离器（D⁺-A⁻），然后形成电荷转移状态。因此，可以通过分子工程手段调节供体/受体单元的给/吸电子能力，实现荧光分子最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）之间能隙（ΔE_gap）的调节，进而实现具有不同NIR-II吸收和荧光发射的荧光探针。

2.2 提高荧光量子产率

针对超高时空分辨率NIR-II荧光成像的前沿需求，设计出具有高荧光强度、高光稳定性的荧光染料是近年来染料化学的研究热点。单键或双键周围的分子内运动导致的非辐射弛豫导致荧光效率随着波长的增加而降低，特别是处于低能带隙的D-A-D小分子。因此，设计具有高荧光量子产率的长波长D-A-D小分子仍然具有挑战性。目前，用于提高D-A-D小分子荧光量子产率的办法主要以下4种：a）引入屏蔽单元；b）抑制扭转分子内电荷转移（TICT）态；c）构建疏水非极性环境；d）构建具有聚集诱导发光（AIE）特性的荧光小分子。

3、有机共轭聚合物

根据荧光亮度公式I_PL= Φ_PLI₀(1-10^-A)，荧光亮度（I_PL）由荧光量子产率（Φ_PL）和吸光度（A）共同决定。D-A-D有机小分子虽然可以通过分子工程技术实现吸收/发射在可见光区至近红外二区范围内的调控，但是该类分子的摩尔吸光系数较低，导致有效NIR-II亮度不高，不利于其在低激发光功率密度激发下深组织穿透成像上的应用。以D-A结构为分子主链的共轭聚合物是一种新型的NIR-II荧光材料，该材料兼具良好的光稳定性和生物相容性。值得指出的是，该类荧光探针可以通过增加重复结构单元的数量来提升分子探针的吸光系数进而提升探针的整体亮度。

2017 年，范曲立团队基于吡咯并吡咯二酮（DPP）设计了一种用于NIR-II荧光成像的共轭聚合物PDFT1032，其最大吸收波长为832 nm，最大发射波长可至1032 nm，具有良好的生物相容性及光稳定性。他们借助NIR-II活体荧光成像技术，成功地将PDFT1032应用于前哨淋巴结活体检测及肿瘤显影。此后，该团队、刘斌团队等又设计合成了一批用于NIR-II荧光成像的新型聚合物探针，其荧光光谱可延至1400 nm，荧光量子产率可达到1.5%，如图4所示。

图4 有机共轭聚合物的化学结构式

4、结束语

NIR-II荧光成像已被广泛应用于基础科学研究和临床前实践。有机NIR-II荧光探针因具有优异的生物相容性、良好的合成再现性以及极高的化学可修饰性而极易实现临床转化。到目前为止，国内外已经开发出了一系列性能优异的NIR-II荧光探针，并基于这些探针实现了信噪比、高时空分辨率活体成像。然而，目前文献报道的绝大多数有机NIR-II荧光探针还不够完善，在临床应用上存在一定的局限性。为了扩大NIR-II荧光探针的生物应用，实现真正意义上的临床化，必须克服以下挑战：（1）开发可经肝脏/肾脏代谢的探针，以解决探针的长期安全性问题。（2）开发内源性NIR-II荧光蛋白，以实现长期生物监测。（3）NIR-II 荧光成像系统的开发和优化。

课题组介绍

北京大学物理学院施可彬研究员团队、北京大学长三角光电科学院高分辨显微成像研究室的研究方向主要为光电子信息技术，超快激光技术以及生物光子学光谱/成像。立足于光学显微成像技术的前瞻性和产业应用，致力于发展光学高分辨显微技术的整机高端装备产业化和商业化。团队研究成果发表在包括Light Sci. Appl.，PNAS，Phys. Rev. Lett.， Laser Photonics Rev.和Opt. Lett.等学术期刊。近五年主持、承担科技部国家重大仪器研发专项项目，自然科学基金重点项目和面上项目等。