封面 | 光电融合成像：实现细胞定点切割

封面解读：封面展示了利用光学导航聚焦离子束减薄技术，在细胞原位制备含有中心体的冷冻超薄切片的示意图。利用三维荧光成像可以准确识别和定位荧光蛋白标记的中心体，再通过关联光镜与电镜图像，可在聚焦离子束图像中精准确定切割目标的位置，从而实现有的放矢的定点减薄。该技术为冷冻电子断层扫描成像提供了新的样品制备方案，可显著提高制样效率和成功率，为探究细胞原位结构提供了有力工具。

原文链接：李尉兴, 卢婧, 肖珂, 纪伟. 荧光导航冷冻聚焦离子束减薄技术的研究进展[J]. 中国激光, 2023, 50(21): 2107102

一、冷冻电子断层扫描成像，解析细胞原位结构

细胞是生命的基本单位，其内部有着十分丰富的细胞器和生物大分子复合体，这些超微结构一方面分工独立，同时又紧密协作。在细胞原位了解这些超微结构，观察细胞器的组织结构、蛋白质的定位和相互作用等，可以揭示细胞内部的分子流程、信号传导以及代谢调控等重要生物学过程，对理解生命的基本原理、研究疾病发生的机制以及开发新的治疗方法都具有重要意义。

冷冻电子断层扫描成像技术（cryo-ET）是目前最前沿的原位成像技术。与传统的电子显微成像相比，cryo-ET在细胞原位结构解析领域具有重要意义。首先，cryo-ET能够在细胞天然状态下进行成像，避免了传统的提纯、固化、染色等制样方法对细胞结构的破坏；第二，cryo-ET可以达到纳米级的分辨率，使研究者能够观察到细胞器、蛋白质复合物和细胞膜等细胞组成部分的详细结构；第三，相比于二维成像技术，cryo-ET通过图像重构可以获得三维结构信息，使研究者能够更好地理解不同细胞组分之间的空间关系和相互作用。

二、荧光导航聚焦离子束减薄，靶向制备细胞原位切片

要利用cryo-ET进行细胞原位观察，首先需要将样品减薄成200 nm左右厚度的薄片。冷冻聚焦离子束（FIB）切割是近年来发展出的一项冷冻生物样品减薄技术，相较于传统的超薄切片技术来说，该技术可以有效避免切割中产生的刀痕、样品扭曲变形等问题，可以切出表面平滑、厚度均一的高质量生物切片，因此逐渐成为cryo-ET样品减薄的主流方法。

最新发展出的荧光导航FIB减薄技术，将荧光成像与FIB切割相结合，利用荧光信号特异性识别和定位研究目标，为FIB的减薄提供导航定位，解决了传统FIB“盲切”的低效问题，实现了细胞内部特定研究目标的精准减薄。荧光导航让FIB切割如虎添翼，有的放矢，是目前cryo-ET原位样品制备的最新技术路线，其实现方式主要有分体式和集成式两种方案。

图1 荧光导航FIB减薄方案。（a）分体式方案；（b）集成式方案 （图片来源：www.nanoscience.com）

（1）分体式荧光导航FIB减薄

在分体式方案中，冷冻荧光成像和FIB切割在两套独立的设备中进行，这种方案具有成本低、实现方式灵活等特点，是发展得较为成熟的一种工作流程。冷冻光镜部分通常可利用现有的荧光显微镜作为成像主体，通过在显微镜上加装冷台实现冷冻光学成像。这类冷冻光镜已有成熟的商业化设备，例如蔡司公司将Linkam冷台整合到自家显微镜中，并利用独有的Airycan技术实现了冷冻高分辨三维共聚焦成像；徕卡公司将自研发的光学冷台、低温物镜和冷冻换样系统集成到自家显微镜中，并提供宽场和共聚焦两种成像方案。这些商业化冷冻光镜可以直接与冷冻双束电镜联用，通过专业软件实现光镜、电镜图像的配准，从而利用光学信号引导FIB的定点减薄。

图2 商业化光学冷台和cryo-FLM成像系统。（a）Instec公司的HCS621GXY冷台；（b）Linkam公司的CMS196冷台；（c）Oxford Instruments公司的MicrostatN冷台；（d）Janis公司的ST500冷台；（e）搭载Linkam冷台的蔡司冷冻共聚焦成像系统；（f）搭载自研发冷台的徕卡冷冻成像系统

（2）集成式荧光导航FIB减薄

集成式方案是最近发展起来的一种一体化荧光导航FIB减薄技术，这项技术将光学显微镜嵌入到冷冻双束电镜内部，在同一真空腔室内实现荧光成像和FIB切割，避免了样品在不同系统间的传输，显著降低了样品转移过程中的冰污染、升温、损坏等风险，提高了整体制样效率和成功率，因此也成为cryo-ET样品制备的下一代热点技术。

2021年，集成式方案形成了两款商业化产品，一款是Delmic公司推出的METEOR光学成像模块，可装配到蔡司、赛默飞等第三方双束电镜中，为双束电镜升级光学成像功能提供了商业化解决方案；另一款是赛默飞公司推出的集成式系统，将自研发的宽场荧光成像模块iFLM集成到Aquilos 2双束电镜中，形成了一套完整的嵌入式荧光导航FIB减薄设备。

图3 商业化集成式cryo-FLM-FIB/SEM系统。（a）Delmic公司可适配双束电镜的宽场荧光成像模块METEOR；（b）搭载METEOR的双束电镜；（c）搭载自研发宽场荧光成像模块iFLM的赛默飞Aquilos 2双束电镜

2023年，中国科学院生物物理研究所孙飞团队和徐涛/纪伟团队分别研发出新型集成式系统ELI-TriScope和CLIEM（如图4所示）。Eli-TriScope通过将宽场荧光成像与FIB/SEM共焦设置，可以在FIB切割过程中实时观察荧光目标在切片中的位置，从而高效引导切割过程。CLIEM则创新性地将三维激光共聚焦显微镜与双束电镜集成，利用高精度三维光学成像确定荧光目标在细胞中的位置，再通过精准的光电关联方法确定切割位点，可实现纳米级别的定点减薄。这两种新方法拓展了集成式荧光导航FIB减薄的应用范围，实现了细胞器和分子级别的定点减薄，成为靶向制备cryo-ET样品新的科研利器。

图4 新型集成式系统三维结构示意图。（a）ELI-TriScope；（b）CLIEM

三、总结与展望

Cryo-ET实现了细胞天然状态下高分辨率的三维结构解析，这使得人们能够直接观察和分析细胞内复杂结构的真实状态，从而更全面地理解生命的最基本单位——细胞的组织和功能，此外还可以帮助人们研究疾病相关的细胞结构变化，揭示疾病的发生机制，为药物研发提供重要的信息。而荧光导航FIB减薄技术的突破，解决了cryo-ET样品定点制备的关键技术瓶颈，为cryo-ET的生物学应用铺平了道路。

集成式设计、降低成本、工作流程自动化、提供更加丰富的光学成像模式是未来荧光导航FIB减薄技术的发展方向。可以预见，随着这项技术的发展与普及，cryo-ET样品制备的准确性和通量都将会显著提升，未来人们可以利用这项技术更好地揭示细胞的奥秘，为生物学和医学领域的研究带来新的突破。

课题组简介

中国科学院生物物理所纪伟研究员课题组长期致力于超分辨成像技术研究及设备研发，并将纳米分辨成像技术拓展应用于细胞原位成像、肿瘤免疫治疗机理研究、肿瘤免疫微环境表征、高分辨荧光病理等研究领域。课题组现有职工7人，博士研究生8人，硕士研究生2人，近年来在国际顶级期刊发表多篇文章（Nature Methods，Nature Communications，Light: Science&Applications等），并授权多项专利。

通信作者简介

纪伟，中国科学院生物物理所研究员，课题组长。获国家杰出青年科学基金、中国科学院青年科学家奖，中国电子显微镜学会优秀青年学者，中国科学院青年创新促进会会员，中国科学院关键技术人才等。主要研究方向是开发纳米分辨率超分辨成像技术及拓展其在细胞原位成像中的应用，其中“干涉单分子定位显微镜”工作入选年度中国生命科学十大进展。