封面 | 三次谐波显微成像：精准识别肿瘤细胞

封面解读：封面展现了利用三次谐波成像技术对正常人脑、脑胶质瘤、肺肿瘤等组织进行显微成像的示意图。这种无标记成像技术基于强脉冲光与生物组织的非线性交互，所揭示的组织信息可以媲美肿瘤诊断中的“金标准”，使其可以对新鲜、未处理的组织进行实时的病理分析，为医生提供更高的成像分辨率和更直观的肿瘤信息，极大地提高了肿瘤术中切除的精准度。

原文链接：薄启宇，吴宇辰，邱斯奇，张志清. 三次谐波显微成像在肿瘤诊断中的应用进展[J]. 中国激光, 2024, 51(3): 0307101

1、癌症治疗亟需术中实时成像技术

手术通常是大多数癌症的主要治疗手段，其关键是肿瘤的完整切除以及正常组织的最大程度保留。然而，目前多数肿瘤在术中主要还是依靠医生肉眼观察和手触诊来识别，这很容易造成肿瘤残留或正常组织过度切除。因此，研发能在癌症术中区分肿瘤与正常组织的成像技术引起了国内外的广泛关注。

常规的医学影像检测技术，如核磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）等，可以提供肿瘤位置、尺寸等宏观信息的粗略诊断，但其分辨率不足以准确地评估肿瘤边界，且这些影像往往是在手术前拍摄的，在手术时难以与实际的肿瘤组织进行精准匹配。基于苏木精和伊红（H&E）染色的组织病理学诊断是临床上肿瘤组织诊断的“金标准”，但H&E病理分析过程繁琐，且结果需要数天才能获得，无法在术中为医生提供实时的组织病理反馈。

近些年，无标记的光学显微成像技术为术中癌症诊断的发展提供了新的前景，如多光子荧光成像、拉曼成像、光学相干断层扫描成像（OCT）、二次和三次谐波显微成像等。这些技术能在无需组织染色标记的情况下直接或间接地揭示肿瘤组织的三维信息，且具有较大的成像深度和较高的成像速度，在术中识别肿瘤边界方面具有重要的临床应用价值。其中，基于光照射组织所产生三倍频光响应的三次谐波（THG）成像是一种独具特色的无标记成像技术。相较于OCT成像，THG能提供更高的成像分辨率和更直观的肿瘤信息。THG成像在装置的复杂度、成本和稳定性上比拉曼成像更具优势。THG成像还可与二次谐波成像（SHG）和双/三光子自发荧光（2PEF/3PEF）成像相兼容，揭示更丰富的肿瘤信息，且所获取的图像质量可与H&E图像相媲美。因此，THG成像在肿瘤术中诊断上具有极大的临床应用潜力。

2、THG成像原理及进展

介质在强脉冲激光照射下会产生非线性的光响应。其中，THG描绘的是三倍频的光学过程，其信号的产生依赖于介质的三阶非线性极化率χ⁽³⁾和一定的相位匹配条件。在生物组织中，THG信号主要来源于脂质分子及其构成的膜状结构。THG成像系统也可收集来自组织中具有非中心对称结构的胶原分子、肌球蛋白等的SHG信号，以及FAD和NADH分子的2PEF/3PEF荧光信号，形成互补的多模态组织信息。这些丰富的组织信号来源使得THG成像系统可以在几秒钟内以亚细胞分辨率对新鲜、未固定、未染色处理的组织进行高质量成像，而且THG成像的多光子过程使其具有光学切片能力，可以对深层组织进行高质量的三维重构，并且不具有荧光成像所固有的光漂白效应。

图1 THG成像的原理和实验方案。（a）THG与自发荧光能级示意图；（b）THG与多光子荧光信号工作波段示意图；（c）在两种介质不同部分是否能输出THG示意；（d）THG显微实验系统示意图

国际上已经有研究者使用THG成像技术对各类肿瘤组织进行成像，验证了其术中揭示肿瘤组织特征并划分肿瘤区域的可行性。

脑胶质瘤的肿瘤细胞侵入性极强，使得肿瘤组织与正常脑组织之间没有明晰的边界，复发率高，而且细胞数量从肿瘤核心到正常组织呈现递减的趋势。Zhang与Groot等人^[1-2]使用THG/SHG成像在新鲜、未处理的低恶性级别和高恶性级别脑胶质瘤组织中直接观测到肿瘤细胞以及细胞增生、细胞核多形性和血管增生等典型的病理学特征，如图2所示。脑细胞信号低于背景，而神经纤维呈现为线性、明亮的物体，刻画了II-IV脑胶质瘤的病理学特征信息在THG图像信息中的不同，比如在II级少突胶质细胞瘤中观测到“fried egg”形态的肿瘤细胞（少突胶质细胞增生引起）以及在II级星形胶质细胞瘤（IDH-mutant）和小胶质瘤细胞瘤中观测到细胞核多形性等。

图2 对人类正常脑组织与脑胶质瘤进行THG（绿色）和SHG（红色）成像，两者重叠处呈黄色。（a）正常脑灰质；（b）正常脑白质；（c）浸润性低级别脑胶质瘤；（d）浸润性高级别脑胶质瘤

肺癌的早期症状与常见呼吸道疾病相近，易错过治疗最佳窗口期，中晚期肺癌治疗需要多次活检取样，导致手术时间延长，增加患者罹患并发症的风险。Groot等人^[3]使用THG/SHG/2PEF对未处理的离体肺癌组织成像，提供了3D连续的深度扫描信息，实现了对肿瘤及周围肺组织中肺细胞、胶原蛋白和弹性蛋白构成的肺泡骨架、动脉、支气管壁等的可视化，如图3所示，可用于识别肺泡组织和肿瘤组织边界、区分典型类癌和腺癌。健康肺组织可见蜂窝状骨架以及巨噬细胞，正常肺泡壁最多有两层肺泡细胞，其细胞核为扁平，而纤维化的肺泡组织由于胶原蛋白增多导致部分肺泡壁增厚。上皮样间皮瘤组织中可见大量异常增殖的肿瘤细胞以及少量的残留胶原。细胞外基质中淋巴细胞小而密的细胞核也会产生明亮的THG斑点，是肺癌的重要预后和预测因素，手术后患者的淋巴细胞越多，存活率越高。

图3 人类健康肺组织与肺癌组织的THG（绿色）、SHG（红色）、2PEF（蓝色）成像，图中其他颜色由这三色叠加而来。（a）新鲜的健康肺组织；（b）新鲜的上皮样间皮瘤组织

目前，大多数基于THG的非线性成像研究仍处于实验室阶段，其设备大且复杂，需要在安全性、稳定性等方面进行改进。荷兰的Groot教授团队和美国的Boppart教授团队已分别研制出了小型化、多模态的可移动THG成像设备，并已在手术室和病理科进行了初步的临床测试，如图4所示。这些小型设备可以在手术中快速地对医生刚切除的组织进行病理分析，提供实时的病理信息反馈，为医生的肿瘤切缘手术或是术中肿瘤分类、分型（针对卵巢癌）提供指导，这将有望提高肿瘤手术的切缘精度。

图4 小型化术中实时诊断设备应用实例。（绘制自荷兰阿姆斯特丹自由大学Groot教授团队研发的便携式紧凑型三次谐波显微成像系统FD1070^[3]）

然而，这些小型化THG成像设备在成像速度和图像智能分析方面还需进一步提升。同时，目前国内还未发展出THG小型成像设备。国际上的小型化THG成像设备目前只能对切除的组织进行快速病理分析，若要对未切除的组织进行分析，则需要使用内窥成像技术，才有可能直接接触或是穿刺病人组织，提供实时病理反馈从而帮助医生判断是否切除所检测的组织。在非线性成像领域，针对THG成像的内窥技术才刚起步，国内外的学者们已经为2PEF、SHG、OCT与拉曼等成像技术研发了相应的内窥镜，为发展THG内窥成像技术的探针设计、光纤选择、扫描模块等的设计提供重要的借鉴作用。

3、总结与展望

THG显微成像技术能够在肿瘤术中对未经处理的肿瘤组织标本进行无标记、快速成像和表征癌症病理。然而，THG成像系统的性能仍有改进空间，其成像视场、成像深度、成像速度还不足以匹配目前临床条件下待手术组织器官的大小与厚度。THG及其同时获取的多模态图像信息与H&E图像揭示的组织病理学信息并不完全吻合，甚至有着更加丰富而复杂的信息，需要研究算法将多模态图像转换为H&E风格的图像，以便于医生便捷地阅读和翻译图像信息。同时，也需要进一步发展基于深度学习的自动化图像分析算法，实现对多模态图像的图像降噪、分割与分类等任务，以及对肿瘤细胞、免疫细胞、血管、EV、NADH/FAD等丰富的肿瘤微环境信息的分类识别。

总体而言，THG成像技术在多类癌症的诊断研究中取得了进展，国际上已发展出可用于术中诊断的小型化成像设备，但是目前的临床测试不够广泛，在术中对肿瘤诊断的精度也尚未明确的报导，THG内窥成像技术也需要进一步研究与发展。可以预见，结合其他非线性技术、生物靶向分子和计算机算法，这项技术可以在临床实现更好地成像效果，为医生和患者带来福祉。

参考文献

[1] Zhang Z Q, de Munck J C, Verburg N, et al. Quantitative Third Harmonic Generation Microscopy for Assessment of Glioma in Human Brain Tissue[J]. Advanced Science, 2019, 6(11): 1900163.

[2] Kuzmin N V, Wesseling P, de Witt Hamer P C, et al. Third harmonic generation imaging for fast, label-free pathology of human brain tumors[J]. Biomedical optics express, 2016, 7(5): 1889-1904.

[3] van Huizen L M G, Radonic T, van Mourik F, et al. Compact portable multiphoton microscopy reveals histopathological hallmarks of unprocessed lung tumor tissue in real time[J]. Translational Biophotonics, 2020, 2(4): e202000009.

通信作者简介

张志清，南开大学副教授、博士生导师。2017年毕业于荷兰阿姆斯特丹自由大学(Vrije Universiteit Amsterdam)物理学院和阿姆斯特丹医学中心(Amsterdam UMC-VUmc)，获博士学位；2017~2020年在阿姆斯特丹自由大学物理学院，进行生物物理方向的博士后研究；2020~2022年在比利时鲁汶大学(KU Leuven)医学院，进行神经科学方向的博士后研究；2022年1月进入南开大学电子信息与光学工程学院现代光学研究所工作，担任副教授，入选南开大学百名青年学科带头人培养计划。主要从事生物医学相关的光学成像研究工作。主要研究方向包括非线性光学显微成像、癌症成像、运动神经元疾病成像、单分子显微成像、纤毛内运输成像以及显微镜图像处理等。以第一作者/通讯作者在PNAS、Advanced Science、Bioinformatics以及Journal of Biophotonics等期刊发表系列论文，并多次在相关国际会议上进行口头报告。