共聚焦激光显微内窥镜（CLE）可以进行在体组织显微成像，实现实时病理学诊断，而光电探测器作为CLE系统的核心部件，影响共聚焦图像质量。对比分析光电倍增管（PMT）和雪崩光电二极管（APD）在CLE中的性能表现，建立基于PMT和APD探测电路的CLE成像信号信噪比分析模型，理论分析光电探测器及其放大电路噪声、放大增益、输入光信号等参数对成像信号信噪比的影响。搭建基于PMT和APD双光路探测系统，对均匀荧光溶液和组织样品进行成像。研究结果表明，当样品荧光功率大于10 nW时，所选取PMTSS与APD120A2的输出图像质量接近，信噪比相差小于0.67 dB，APD以更高的性价比实现与PMT相当的成像性能。

激光散斑衬比成像(LSCI)技术广泛应用于大视场的组织表层血流成像,当需要实时在体监测生物体深层组织或腔内组织的血流分布及变化时,将LSCI与内镜成像技术结合是解决LSCI成像深度问题的有效途径。为此,搭建了商用腹腔镜LSCI成像系统,并对微流体仿体和兔子大肠进行成像。实验结果表明,所搭建的系统可以校正静态散射以及消除系统噪声对散斑衬比度的影响,利用单次曝光下的散斑衬比测量值可以实现血流的定量监测,该商用腹腔镜LSCI成像系统将具有重要的临床应用潜力。

使用往复式逐行扫描的方式可以提高激光共聚焦显微内窥镜的成像速度和数据利用率, 但这种扫描方式也会带来图像畸变和错位问题, 从而影响系统成像质量。受扫描畸变影响, 图像错位程度不一致, 后期处理难以得到理想的校正效果。本文基于共振振镜的运动规律, 推导了均匀空间采样过程中的采样时间函数, 通过非等时采样方法校正了振镜速度变化带来的横向畸变。利用互相关法评价图像错位程度, 采用遗传算法获得最优的采样开始时刻, 实现了图像错位的校正。最终通过调整采样开始时刻和时间间隔在数据采集环节校正了图像畸变和错位。为了验证图像畸变校正和错位校正效果, 本文搭建了基于往复式逐行扫描方式的激光共聚焦显微内窥成像系统。实验结果表明, 该方法能够有效地校正图像畸变和错位, 图像的横向分辨率。与现有方法相比, 本文方法将图像的局部分辨率由10 pixel提高到6 pixel。

为了将荧光分子成像技术应用于临床进行手术导航、肿瘤边界识别、在体显微病理诊断等, 设计了一种双模切换显微内窥镜成像系统, 采用荧光素钠作为荧光分子探针, 高亮度蓝光LED光源作为荧光激发光源, 通过切换内窥成像探头, 实现了两个模态下的成像: 宽场白光内窥成像模式下进行手术导航, 荧光分子成像进行病变肿瘤边界识别; 显微内窥成像模式下, 进行在体显微病理分析, 确定肿瘤良恶性及其种类。本文研究了双模切换显微内窥镜成像系统的光学特性, 搭建系统并测试了相关的性能指标, 展示了该系统在小鼠肝脏多模式内窥成像下的效果。研究结果表明: 宽场内窥成像可以实现组织颜色和边界特征识别, 显微内镜成像系统可以实现分辨率达4.4 μm的组织显微成像, 能够满足在体肿瘤实时手术导航和显微病理诊断的临床需求。

数字微镜器件(DMD)的灵活性有助于实现并行共焦成像。设计并搭建了基于DMD的并行共焦成像系统,分析了DMD光点阵列对轴向分辨率、横向分辨率和图像对比度的影响,得出了最优光点阵列参数。结果表明:光点越小,则横向和轴向分辨率越高;当光点间距大于光点大小时,增大光点间距对成像的横向分辨率无明显改善;对于1×1微镜,光点间距为光点大小的4倍时对应的图像对比度最高,即1×1光点大小、4倍光点间距为最优光点阵列。对数值孔径为0.25的物镜而言,最优光点阵列对应的横向分辨率优于512 lp/mm,轴向分辨率可达7.82 μm,均达到衍射极限。基于最优光点阵列的三维体光栅成像比宽场成像具有更高的分辨率和明显的层切效果,与激光扫描共焦成像相比无较大差距。基于DMD的并行共焦成像系统在保证高速成像的前提下,实现了高分辨率和高图像对比度的光学层切成像,在实时成像和三维成像中有一定的优势和应用前景。

结构光照明荧光显微术(SIM)是一种可突破阿贝衍射极限的宽场显微成像技术, 因其非侵入、成像速度快及光损伤小等优点在生物医学研究中具有广泛的应用前景。从结构光照明显微成像系统基本原理出发, 分析了超分辨图像重构算法原理、重构图像中伪影来源及优化方法; 结合研制的线性/非线性结构光照明显微镜, 详细讨论了基于激光干涉的SIM成像系统光机结构。重点讨论了系统的同步时序设计和光路中的几个关键技术问题。设计对比实验验证了自主开发的SIM重构算法的可靠性, 并基于研制的线性SIM系统开展细胞骨架的成像实验。最后, 对SIM技术在生物上的发展和应用提出展望。

为了修正显微镜点扩散函数荧光微球传统测量方法中微球直径对测量结果的影响、提高显微镜点扩散函数的测量精度, 采用理论仿真、最小二乘拟合的方法, 建立荧光微球等效2维浓度分布, 模拟仿真了荧光微球显微成像过程; 利用最小二乘拟合以及残差拟合的方法, 得到荧光微球直径、荧光微球强度分布半峰全宽与系统实际点扩散函数半峰全宽之间的关系模型, 由此模型得到较为准确的系统点扩散函数半峰全宽。结果表明, 使用100nm荧光微球对系统点扩散函数进行测量时, 相对误差在1%左右。此研究结果说明通过该修正模型可以得到较为准确的系统点扩散函数。

传统荧光显微镜的分辨率受到光学衍射极限的限制。使用结构光照明技术，可以实现突破衍射极限的超分辨成像。相对于其他突破衍射极限的超分辨成像方法，结构光照明显微技术具有装置结构简单、成像速度快等优势，在生命科学研究中发挥了重要作用。首先分析了基于结构光照明的二维超分辨率荧光成像、三维层析荧光成像和非线性结构光照明超分辨荧光显微成像的原理和图像处理算法，并根据不同的结构光产生机理，对基于光栅光调制、基于液晶空间光调制器光调制和基于数字微镜阵列光调制的结构光照明荧光显微镜装置做了阐述和比较，最后概述了结构光照明荧光显微镜在观察生物样品结构特性和动态特性中的应用。