1 华中科技大学分析测试中心, 湖北 武汉 430074
2 中国计量科学研究院前沿计量科学中心, 北京 100029
3 华中科技大学能源与动力工程学院, 湖北 武汉 430074
圆二色（CD）光谱是一种公认的用于测量蛋白质及其二级结构的生物物理技术, 不但被广泛用于测量蛋白质的二级结构, 而且可以检测二级及更高级结构的变化, 同时用于科学研究和蛋白质产品如生物制药的质量控制。 由于对CD光谱测量中的误差来源定量理解有限, 对光谱进行客观比较仍具有挑战性。 统计方法可用于比较, 但不提供处理系统性以及随机性误差的机制。 在任意两台仪器中进行的CD测量, 即使在可比较的条件下, 相同样品的光谱幅度（elipticity椭圆度, CD scale, 也称圆二色值）或波长也可能存在细微差异。 光源、 最终的光度输出和各个仪器之间入射光偏振的微小差异是导致圆二色值或波长产生差异的可能原因。 分析蛋白质CD光谱取决于原始CD数据的质量, CD解卷积分析强烈依赖于CD光谱中谱峰的圆二色值。 因此, 以一种α-螺旋为主导的蛋白质—细胞色素C为实验对象, 在对CD光谱仪进行校准的前提下, 对其浓度为0.05 mg·mL-1的水溶液进行圆二色光谱测定, 继而建立了0.05 mg·mL-1细胞色素C水溶液的CD光谱测量模型, 评估了其在波长222 nm谱峰圆二色值的不确定度。 圆二色值的不确定度来源主要有测量重复性、 校准溶液及蛋白溶液浓度的不确定度、 比色皿光程长的不确定度等。 经过仪器校准后, 综合考虑这些不确定来源, 得到0.05 mg·mL-1细胞色素C水溶液在波长为222 nm处谱峰的圆二色值及不确定度为(-4.53±0.54) mdeg, k=2。 通过不确定度评估, 发现在不确定分量中较为显着的为1 mm比色皿光程长不确定度和溶液配置过程引入的不确定度分量, 设法消除或降低这些因素的影响, 可以改进测量方法分析测量过程, 以实现CD光谱的客观比较, 提高CD谱图的可比性和可靠性, 为开展圆二色光谱测量的实验室间比对提供实验参考。
蛋白质 圆二色 光谱 二级结构 圆二色值 不确定度评估 细胞色素C 可比性 Protein Circular dichroism Spectroscopy Secondary structure Magnitude Uncertainty estimation Cytochrome C Comparability 光谱学与光谱分析
2023, 43(10): 3105
1 大连大学生命科学与技术学院,辽宁 大连 11622
2 大连大学环境与化学工程学院,辽宁 大连 116622
3 辽宁省生物有机化学重点实验室,大连大学,辽宁 大连 116622
在生命体内有关电子转移的研究备受关注, 其中蛋白质以及酶之间的电子转移研究已成为热点, 目前有关光诱导血红素蛋白还原的详细机理尚不明确, 电子转移也许是解释这一机理的有效途径。 通过紫外-可见吸收光谱、 稳态荧光光谱和圆二色等光谱系统地研究了体外近生理溶液环境中, 不同的紫外定波长、 pH、 游离氨基酸、 谷胱甘肽、 咪唑对Cyt b5光照还原的影响, 以阐明Cyt b5不能用传统提出的机制去解释的光还原机制。 结果表明: 在近紫外区通过直接的光激发高铁细胞色素b5 (Cyt b5)可以使其被还原成亚铁Cyt b5, 经过分析发现了Cyt b5被光还原的机制和促进条件。 用280 nm单色光照射Cyt b5溶液, 发现随着光照时间的延长, Cyt b5溶液紫外-可见光谱中Soret带由412 nm红移到421 nm, Q带556 nm处吸收峰逐渐增强。 Cyt b5被光照后发生了类似化学还原剂作用的还原反应, 同时发现了不同的光照波长、 不同的pH、 氨基酸种类以及各种其他配体等存在下对Cyt b5的还原程度影响不同。 采用280 nm波长、 在偏碱性条件下光照Cyt b5时还原程度最强; 溶液中加入谷胱甘肽和咪唑能通过提供电子和氢供体途径促进Cyt b5的光照还原反应发生; 溶液中游离Met的存在能以最大速率促进光照还原反应的发生。 基于以上结果提出Cyt b5光还原的机理是从卟啉环到三价铁的电子转移, 通过280 nm激发形成卟啉π阳离子基团和亚铁。 采用稳态荧光光谱和圆二色谱对Cyt b5光照还原发生前后进行检测, 发现光诱导蛋白发生还原后, Cyt b5主链结构逐渐伸展, 二级结构发生了一定改变, α-螺旋含量逐渐降低, β-折叠含量逐渐升高, 但是整个Cyt b5的二级结构仍以α-螺旋为主。 该研究结果不仅对了解光对含血红素蛋白(酶)的结构和功能的影响有重要的理论和实践意义, 而且对于生命体内的氧化还原反应和电子传递机制提供一定理论依据。
细胞色素b5 光诱导 氧化还原 光谱 Cytochrome b5 Photo-induced Oxidation-Reduction Reaction Spectroscopy
1 省部共建淡水鱼类发育生物学重点实验室, 湖南师范大学生命科学学院, 湖南 长沙 410081
2 汉寿县特种水产科学研究所, 湖南 常德 415900
本文以汉寿中华鳖为研究材料, 比较分析中华鳖线粒体细胞色素b基因(Cytb)与瑞鳖、砂鳖等的差异, 为探讨其进化与遗传分子标记奠定实验基础。采用PCR技术, 克隆汉寿中华鳖Cytb基因的序列, 并检测其在不同组织以及不同生长发育时期的表达模式, 最后通过分子进化树分析中华鳖与砂鳖的亲缘关系。通过克隆发现中华鳖细胞色素b基因的mRNA开放阅读框含有1 140 bp, 其碱基组成为A+T的含量(61.1%)高于G+C(38.9%), 编码379个氨基酸残基的序列。与山瑞鳖和砂鳖氨基酸序列比较发现, 中华鳖与瑞鳖和砂鳖均存在一定差异; Cytb基因在中华鳖不同组织和各个不同发育时期中均有表达, 且在精巢组织中表达量最高, 在不同时期阶段呈“低-高-低”曲线表达模式; 分子进化树分析发现汉寿中华鳖与砂鳖具有较强的亲缘关系, 但是在Cytb中仍存在差异, 所以能够很好的把它们区分开来。此外汉寿中华鳖与哺乳动物、鱼类和爬行类均存在巨大差异。结果表明, Cytb基因在探讨汉寿中华鳖的进化与遗传分子标记中具有重要意义, 可作为分析中华鳖种属进化系统发育特性和群体遗传多样性的标记基因。
中华鳖 线粒体细胞色素b 克隆 遗传多样性 Trionyx sinensis mitochondria cytochrome b cloning genetic diversity
1 大连大学生命科学与技术学院, 辽宁 大连 116622
2 辽宁省生物有机化学重点实验室, 辽宁 大连 116622
3 吉林大学生命科学学院, 吉林 长春 130012
细胞色素C(Cytochrome, Cyt c)作为细胞内线粒体的电子传递体, 与NO之间的相互作用结果对于线粒体凋亡的检测有着重要的生物学意义。 采用紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱、 电子顺磁技术(EPR)、 时间过程光谱、 圆二色(CD)光谱和同步荧光光谱等方法对处于不同价态的Cyt c与NO替代物, 即proliNO/NO(proliNONOate)的相互作用过程, 以及Cyt c在结合NO过程中蛋白空间结构的变化进行了详细研究。 实验结果发现: 在模拟生理条件下, 不同价态的Cyt c都能够直接与NO替代物(proliNO/NO)所产生的NO发生配位反应。 推断出Cyt c与NO之间相互作用发生的可能机制: NO与Cyt c结合过程, 是因为与Cyt c中Fe配位的轴向配体以及卟啉周围的取代基变化而发生结合的。 具体反应过程为: 溶液中的NO诱导Cyt c中的Heme上Met80远离原来位置, Fe—S键断裂, 进而空出的Fe与NO结合生成Fe—N键, 从而生成新的Cyt c-NO配合物。 研究表明: Cyt c-NO二元复合物不稳定, 会发生光解离反应, 通过线性拟合得出: 其解离过程属于准一级反应, 解离速率为(0.071 1±0.039 6) s-1。 同时, 血红素Fe与NO间新键的形成, 影响了色氨酸和酪氨酸微环境的变化； Cyt c二级结构受proliNO/NO浓度的影响, 当proliNO/NO浓度低于8.6×10-4 mol·L-1时, Cyt c的α-螺旋特征峰强度变化很小, 且位置不变； 但proliNO/NO浓度高于8.6×10-4 mol·L-1时, 即过量, Cyt c的二级结构变化很明显, 说明过量的NO能导致Cyt c二级结构的破坏。 NO与Cyt c配位反应机制的研究对于利用NO抑制线粒体内的氧气消耗, 以及线粒体内NO的代谢具有重要的意义。
细胞色素C 配位反应 解离 Cytochrome c ProliNONOate proliNONOate Coordination reaction Dissociation 光谱学与光谱分析
2017, 37(8): 2505
1 昆明理工大学生物工程技术研究中心, 云南 昆明 650500
2 广西科学院生物物理实验室, 广西 南宁 530007
运用激光镊子拉曼光谱技术（LTRS）研究铝胁迫下土生隐球酵母细胞和线粒体拉曼光谱变化。细胞和线粒体中与核酸、蛋白质和脂类相关的特征峰强度随着铝处理浓度和处理时间的增加而逐渐降低，表明细胞凋亡过程中细胞和线粒体内的核酸、蛋白质和脂类生物大分子逐渐减少。线粒体内与细胞色素c（Cyt c）相关的特征峰强度随铝处理浓度增大和处理时间的延长而显著降低，说明线粒体中的细胞色素c释放到线粒体外。线粒体的呼吸峰随着铝浓度的增加和处理时间的延长而降低，说明线粒体的活性不断减弱，能量代谢受阻。因此，拉曼光谱实时监测了铝胁迫细胞凋亡的动态过程及其线粒体的生理生化变化过程，并且揭示了铝诱导土生隐球酵母凋亡过程中线粒体内细胞色素c的释放行为，这些结果有助于了解酸性土壤中铝对生物的毒害机理。
光谱学 土生隐球酵母 铝胁迫 细胞凋亡 线粒体 细胞色素c 中国激光
2014, 41(11): 1115002
1 安徽农业大学动物科技学院, 安徽 合肥 230036
2 安徽农业大学生命科学学院, 安徽 合肥 230036
利用黄牛基因组cDNA和氨基酸数据库对P450基因进行搜索和分析, 结果显示: 在黄牛基因组中发现64个P450基因, 分别属于18个P450家族和38个亚家族。以氨基酸序列相似度大于60 %为标准对黄牛P450基因进行分组, 32个为孤儿基因, 其余32个可归入9个组, 其中7个组适合于正选择和基因转换分析。结果表明: 有3个组显著受到正选择压力作用, 其中的2个组有正选择概率大于95 %的氨基酸位点, 分别位于底物识别位点SRS1和SRS2; 有5个组显示显著的基因转换事件; 既显著受到正选择压力作用, 又参与基因转换的基因共4个。可见, 发生基因转换的基因与受到显著正选择的基因有一定的相关性。此外, 鉴定出20个不同的基序, 其中有6条基序在90 ％以上的基因中出现。
黄牛 细胞色素P450 正选择 基因转换 基序 Bos taurus cytochrome P450 positive selection gene conversion motif
安徽师范大学生命科学学院重要生物资源保护与利用安徽省重点实验室,安徽,芜湖,241000
利用线粒体12S rRNA基因和Cyt b基因部分序列,通过DNA序列比对的方法,对毫州市药品监督管理局送检的三件猴骨样品(BZ01、BZ02和BZ03)进行了分子鉴定.结果表明,BZ01号样品为藏酋猴(Macaca thibetana),BZ02和BZ03号样品为猕猴(Macaca mulatta).通过本文的研究,作者还提出,在利用DNA序列比对法进行近缘物种的鉴定时,不同种群间的DNA序列变异,可能对结果造成一定的影响.
细胞色素b(Cyt b) 分子鉴定 猴骨 12S rRNA
1 南京师范大学生命科学院,中国南京,210097
2 东南大学基础医学院,中国南京,210004
对麂属(Muntiacus)中的3种动物:赤麂(M.muntjak)(2n＝6♀,7),小麂(M.reevesi)(2n＝46),黑(M.crinifrons)(2♀,9)线粒体DNA 12SrRNA和细胞色素B基因783bp左右的片段进行序列分析,并根据序列信息建立分子系统树,同时探讨了这3种动物的起源、分类地位及进化关系.
麂属 12SrRNA基因 细胞色素B基因 DNA序列分析 分子进化 Muntiacus 12SrRNA gene cytochrome B gene DNA seque
