1 引　言

恶性黑色素瘤是一种多发于皮肤部位的恶性肿瘤，其发病率在皮肤恶性肿瘤中排第三位。目前黑色素瘤的治疗主要采用光动力疗法^[1]。光动力治疗是将能够响应特殊波段的光敏剂注射到患者的病变部位，采用一定功率的激光照射病变部位从而激活光敏剂的毒性作用杀死癌细胞。传统的光敏剂如原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）主要是由635 nm波段激光激发，吸收光能之后将能量传递给周围的物质并产生具有一定细胞毒性的活性氧，从而发挥良好的光动力疗效^[2]。活性氧（reactive oxygen species， ROS）除了具有细胞毒性，同时还会导致其下游的Caspase-3蛋白高表达并活化，起到一定的基因调控作用^[3]。

细胞焦亡（pyroptosis）是细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）方式的一种，通过诱导癌细胞焦亡可以达到杀死肿瘤细胞的目的。细胞焦亡的通路有很多，其中Caspase-3蛋白和GSDME蛋白的相互作用就能导致细胞焦亡。GSDME是细胞内的一种抑癌基因，其在大多数癌细胞中被抑制，去甲基化药物可以增加GSDME蛋白的表达量^[4-5]。而当机体内的GSDME蛋白含量上升时，活化的Caspase-3会切割GSDME蛋白使其断裂为GSDME-C和GSDME-N两段，此时GSDME-N蛋白会与细胞膜结合导致细胞膜穿孔破裂，造成细胞焦亡的现象^[6-8]，其表现为细胞膜肿胀破裂，细胞内容物流出，可以通过显微镜很直观地区分出焦亡细胞和正常细胞。随着对焦亡的深入研究，诱导细胞焦亡也被当作一种肿瘤治疗的手段。

本文结合光动力治疗与细胞焦亡的原理，通过自组装的方式合成出一种新型的光敏剂药物，以生物学的表征手段在细胞水平验证了其能够有效地杀伤肿瘤细胞，提升了传统光敏剂的治疗效果，也为黑色素瘤的协同治疗提供了一种新的思路。

1 实验方法

1.1 光敏剂药物的制备

首先合成了用于包裹药物的大分子聚合物PMHC₁₈-mPEG^[9]，然后利用自组装的方法将PpIX和去甲基化药物SGI-1027包覆起来形成SGI@ PpIX-mPEG复合体系溶液，具体的实验材料与方法如下：

（1）材料与化学试剂

原卟啉IX（PpIX)(购买于上海阿拉丁生化科技有限公司），SGI-1027（购买于MCE），马来酸酐/1–十八碳烯交替共聚物（polymaleic anhydride-alt-1-octadecene）(购买于天津希恩思生化科技有限公司），聚乙二醇单甲醚（polyethylene glycol methyl ether)(购买于上海阿拉丁生化科技有限公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO)(购买于Sigma），吡啶（C₅H₅N)(购买于国药集团化学试剂有限公司），1–乙基–3–（3–二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCL)(购买于国药集团化学试剂有限公司）。

（2）PMHC₁₈-mPEG的制备

称取马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物（20 mg，0.0286 mmol）与聚乙二醇单甲醚（228.6 mg，0.05714 mmol，mPEG-NH2，2 KDa），放入30 mL的DMSO与吡啶的混合溶液（两种溶液的体积比DMSO∶吡啶= 9∶1）中反应12 h，随后加入1–乙基–3–（3–二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（43.6 mg，0.11 mmol），充分反应24 h之后将所得聚合物通过用蒸馏水透析12000~14000 MWCO的方式纯化去除副产物。通过冻干法除去溶剂，得到420 mg黄色固体，产率约为71%。

（3）SGI@ PpIX-mPEG的制备

将4 mg的PpIX和0.8 mg的SGI-1027溶解在200 μL的DMSO中，然后将10 mg的PMHC₁₈-mPEG溶解在4 mL水中。剧烈搅拌PMHC₁₈-mPEG水溶液的同时滴加含有PpIX和SGI-1027的混合溶液，搅拌的过程中注意避光，搅拌约20 min后获得SGI@ PpIX-mPEG溶液。获得的SGI@ PpIX-mPEG溶液需要避光保存在4 ℃的环境中，避免材料受到光照影响导致失效。

1.2 材料形貌表征

利用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）来观察SGI@ PpIX-mPEG的形貌特征。TEM具有极高的分辨率，能够观察到小于0.2 μm的亚显微结构，其采用电子束作为光源，经过加速的电子束照射到样品表面并与样品原子发生一系列的碰撞从而产生不同的立体角散射，经过成像器件的收集可得到明暗不同的样品影像，所以TEM被广泛应用于材料科学领域。样品的厚度对TEM的成像质量具有较大的影响。首先将SGI@ PpIX-mPEG溶液滴加到带有支持膜的铜网之上，等待样品干燥从而使其均匀的分散到支持网之上，随后可以进行透射电镜的拍摄。

1.3 细胞培养

本文采用人类恶性黑色素瘤A375细胞作为实验对象。采用DMEM高糖培养基培养A375细胞，培养基中含有10%的胎牛血清以及1%的双抗。细胞放置在37 ℃恒温培养箱中，培养箱含有体积分数为5%的二氧化碳。

1.4 细胞吞噬实验

将A375细胞提前铺在底部直径为14 mm的共聚焦小皿之中，在37 ℃培养箱中放置24 h后，加入培养基稀释后的质量浓度为100 μg/mL的SGI@ PpIX-mPEG，分别在2 h，4 h，12 h，24 h 4个时间段用共聚焦显微镜捕获细胞的吞噬情况。为了确定新型光敏剂药物SGI@ PpIX-mPEG在细胞内的相对位置，需要对细胞核进行定位。本实验采用Hoechst 33258染色液对细胞核进行定位，它是一种能够同时作用于活细胞与死细胞的细胞核的荧光染料，结合之后能够被激发出蓝色荧光，最大发射波长为460 nm。在进行拍摄之前，轻轻用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗每组共聚焦小皿，然后将Hoechst 33258染色液用PBS稀释100倍并加入每个实验组之中。染色10 min后，洗去染色液，用共聚焦显微镜获取细胞吞噬图像。

1.5 DCFH-DA染色实验

DCFH-DA染色实验步骤如下：将细胞铺入共聚焦小皿之中，待细胞贴壁之后，在不同的小皿中分别加入10 μg/mL的SGI-1027、100 μg/mL PpIX以及100 μg/mL的 SGI@ PpIX-mPEG与细胞共同孵育2 h，其中Control组中只含有A375细胞，不加入任何材料。用功率密度为50 mW/cm²的635 nm激光对每个小皿进行光照处理5 min。之后去除细胞培养液上清，用PBS轻轻冲洗每孔，然后加入浓度为10 μmol/L的DCFH-DA染色探针。染色10 min后，再次用PBS轻轻冲洗，置于共聚焦显微镜下拍摄图像。

1.6 细胞形态表征

细胞形态的表征实验处理方法同前，同样是分为Control、SGI-1027、PpIX和SGI@ PpIX-mPEG 4组。在进行共聚焦显微镜拍摄之前，将小皿中的细胞培养上清液从边缘缓慢用移液枪吸出，避免死亡的细胞由于与小皿脱离而被过大的吸力吸出，导致小皿中细胞数量减少。之后利用PBS轻轻冲洗一遍，然后加入用PSB稀释后的浓度为10 μmol/L的SYTOX GREEN荧光染料，避光孵育7~8 min，孵育时间不宜过长。最后吸出染色液，用PBS轻轻把未结合的SYTOX GREEN荧光染料冲洗干净之后就能进行共聚焦显微镜表征实验。

1.7 CCK-8实验

首先将A375细胞接种在96孔培养板之中预培养一段时间，实验组别处理方式同上。测量时每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃培养箱中反应30 min左右，采用酶标仪测量每孔在450 nm处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 SGI@ PpIX-mPEG的形态表征

得到合成的样品之后，首先需要对样品的形态进行表征。图1（a）是SGI@ PpIX-mPEG的TEM图像，可以看出SGI@ PpIX-mPEG呈现出圆形颗粒状，形貌均一，具有良好的一致性，其平均粒径约在100 nm。图1（b）是SGI@ PpIX-mPEG溶液在比色皿中的图像，溶液整体呈褐红色，无明显沉淀物，说明所合成的SGI@ PpIX-mPEG具有良好的水溶性。由此可见，PMHC₁₈-mPEG成功地将PpIX和SGI-1027包裹起来形成SGI@ PpIX-mPEG复合体系，符合实验的预期设计。

图 1. SGI@ PpIX-mPEG形态表征图像

Fig. 1. Morphological characterization of SGI@ PpIX-mPEG

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2.2 SGI@ PpIX-mPEG的细胞吞噬情况研究

为了确保光敏剂药物能够进入细胞内发挥作用，首先对细胞吞噬SGI@ PpIX-mPEG的情况利用共聚焦显微镜进行表征。如图2所示，图中红色荧光代表SGI@ PpIX-mPEG，蓝色荧光为Hochest 33258染色之后的细胞核。可以看出，在细胞核的周围环绕着一圈红色荧光，证明SGI@ PpIX-mPEG已经进入细胞质之中，并且A375细胞在与SGI@ PpIX-mPEG孵育2 h之后就已经展现出良好的吞噬能力，在24 h之后红色荧光依然存在，证明所合成的新型光敏剂药物不仅具有良好的生物相容性，并且能够在体内保持稳定结构从而避免药物失效的情况。

图 2. SGI@ PpIX-mPEG在细胞内的吞噬图像

Fig. 2. Phagocytosis images of SGI@ PpIX-mPEG in cells

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2.3 SGI@ PpIX-mPEG产生ROS能力的研究

为了验证SGI@ PpIX-mPEG是否和PpIX一样具有产生ROS的能力，采用DCFH-DA荧光染色的方法来探究细胞内ROS的产生水平。DCFH-DA是一种本身不具有荧光的化学探针，其进入细胞后会被酯酶水解为能够与ROS发生氧化反应的DCFH，其氧化产物为带有绿色荧光的DCF，能够被488 nm波段的激光激发产生强烈的绿光，其最大发射波长为525 nm，可以通过荧光显微镜捕获并进行ROS定量分析^[10]。

图3（a）~（d）所示分别为共聚焦显微镜下Control、SGI-1027、PpIX以及SGI@ PpIX-mPEG4组实验组中ROS产生情况的图片，图中的绿色荧光代表活性氧的产生。Control组和SGI-1027组由于不能产生活性氧，所以视野中几乎看不到绿色荧光。而在PpIX以及SGI@ PpIX-mPEG两组之中出现大量的荧光，并且从两组中的对比可以看出，合成的新型光敏剂药物SGI@ PpIX-mPEG并不会影响PpIX本身产生活性氧的能力，甚至在一定程度上加强了活性氧的生成。利用Origin软件对每张图片的平均荧光强度进行分析，如图3（e）所示，SGI@ PpIX-mPEG组的平均荧光强度达到了87.20，比PpIX组高了7左右，而Control组和SGI-1027却只有22.86和27.93，进一步证明所合成的SGI@ PpIX-mPEG是性能优异的光敏材料。

图 3. ROS的表征

Fig. 3. The characterization of ROS

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2.4 细胞焦亡形态的表征

随后对SGI@ PpIX-mPEG诱导A375细胞焦亡的能力进行评估，仍然是用细胞染色的方法并用共聚焦显微镜进行结果表征，形态表征的实验处理方式同上。在拍摄之前，为了直观地看出细胞是否死亡，利用SYTOX GREEN对每组细胞进行染色处理。SYTOX GREEN是一种针对死细胞的染料，能够穿过死亡细胞的细胞膜并与细胞内的核酸结合，在488 nm激光光源的激发下产生绿色荧光^[11]。

图4是共聚焦显微镜下拍摄的所有组别中细胞的形态表征。在绿色通道之中，Control组和SGI-1027组中没有出现绿色荧光，而PpIX和SGI@ PpIX-mPEG组中则出现了大量荧光，说明经过635 nm激光光照之后，PpIX和SGI@ PpIX-mPEG都表现出了其细胞杀伤性导致A375细胞死亡，而SGI-1027并不能导致癌细胞死亡。在共聚焦显微镜明场的视野下，Control组和SGI-1027组中的细胞形态都没有发生明显变化，而在SGI@ PpIX-mPEG组中很明显地观察到细胞呈现出肿胀状态，细胞膜与细胞内容物出现分离的趋势，表现出焦亡的细胞形态。PpIX组中的细胞虽然已经死亡，但是却没有呈现出细胞焦亡的形态，而是表现出皱缩破碎形态，这是细胞凋亡的典型特征。其产生的原因是由于细胞内的活性氧水平的上升，而活性氧是调控凋亡通路关键蛋白Caspase-3的重要物质^[12-13]。图4（b）和图5（d）中红色虚线框表示的是对PpIX组和SGI@ PpIX-mPEG组中图像局部区域的放大，可以更为显著地观察到经过两种不同处理方式之后A375细胞形态之间的差异。由此可见，所合成的SGI@ PpIX-mPEG能够诱导A375细胞走向焦亡，并且有显著的杀伤作用。

图 4. 焦亡形态表征

Fig. 4. The characterization of pyroptosis

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2.5 SGI@ PpIX-mPEG光动力疗效的研究

为了对比传统的光敏剂PpIX与合成的新型光敏剂药物SGI@ PpIX-mPEG光动力治疗效果方面的差异，采用常用的细胞毒性实验CCK-8来评估不同实验组之间细胞存活率的差异。CCK-8试剂中含有水溶性四唑盐-WST-8，在细胞微环境下会被还原成黄色甲瓒产物，其含量越多证明体系中存在的活细胞数量越多，因此被广泛应用于细胞毒性或药物筛选等实验^[14-15]。

如图5所示是各组别细胞存活率的柱状图，图中SGI-1027组的细胞存活率为87.66%，较Control组没有显著差别，证明该组别的细胞毒性较小。SGI@ PpIX-mPEG组的细胞存活率仅有28.34%，比PpIX组的39.12%降低了10.78%，说明SGI@ PpIX-mPEG通过细胞焦亡的方式杀伤肿瘤细胞的效果要优于传统光敏剂PpIX的光动力治疗效果，与预期的实验结果基本保持一致。

图 5. 细胞存活率检测

Fig. 5. Cell viability assay

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3 结　论

本文在传统光敏剂PpIX的基础上，利用聚合物PMHC₁₈-mPEG的自组装特性，将去甲基化药物SGI-1027与传统光敏剂构建成黑色素瘤的协同治疗体系，在光动力治疗的基础上引入了细胞焦亡的治疗手段，通过共聚焦显微镜的表征验证所合成的SGI@ PpIX-mPEG不仅能够产生活性氧杀死癌细胞并且能够导致癌细胞焦亡。且通过细胞毒性实验发现当SGI@ PpIX-mPEG作用于A375恶性黑色素瘤细胞时治疗效果相对于传统的光动力治疗提升了10.78%，在一定程度上改良了传统的光敏剂，并且通过细胞吞噬实验证明此新型光敏剂药物具有良好的生物相容性，可以在短时间内进入细胞并发挥作用，有望在黑色素瘤治疗的领域得到进一步应用。