牙髓疾病是影响人类口腔健康的主要疾病, 细菌感染是临床上牙髓损伤最常见的原因, 龋病是引起牙髓细菌感染最主要的途径^[1], 如何保存活髓治疗牙髓疾病一直是难点之一。采用生物活性材料作为盖髓剂进行保髓治疗是临床治疗损伤牙髓的主要方案^[2]。盖髓剂可以保存活髓、治疗细菌感染、促进根尖发育完全, 针对意外露髓, 尤其是根尖未发育完全的年轻恒牙具有较好的治疗效果^[3]。目前临床常用的盖髓剂分为丁香酚和氢氧化钙两类, 其中, 丁香酚具有抑菌和局部镇痛的功效, 混合氧化锌后可作为安抚剂用于间接盖髓、根管充填及暂封^[4]; 氢氧化钙作为最常用且价格低廉的盖髓剂, 其抑菌性能良好, 溶于水后呈强碱性, 可中和细菌酸性产物, 促进矿物质沉积, 并诱导修复性牙本质生成, 被用于评价盖髓剂性能的金标准^[5]。

临床用盖髓剂具有良好的封闭性、较强的杀菌和抑菌能力^[6], 其抑菌性能有助于抑制细菌对牙髓组织的损伤, 从而保存牙髓活力, 促进牙髓组织修复愈合。不同盖髓剂各有其功能特点。Leye等^[7]发现Dycal具有形成牙本质桥迅速、引起牙髓炎症轻微的优点。Applerot等^[8]揭示了ZnO优异的抗菌能力及其机理, 其抗菌作用由ZnO颗粒与细菌膜接触产生, 其抗菌机理源于ZnO表面与水的反应提高了活性氧即羟自由基水平, 进而杀死细菌。Fisher等^[9]通过体内实验验证了氢氧化钙具有良好的抗菌性。除抗菌性能外, 各种盖髓剂与牙髓干细胞(Human Dental Pulp Stem Cells, HDPSCs)的细胞相容性同样值得关注。研究表明, 丁香酚对HDPSCs的毒性作用因浓度不同而差异较大^[10], 因时间不同(1 h到32 d)而有所不同^[11],高浓度的丁香酚对细胞均显示出毒性作用。Jun等^[12]利用氧化锌丁香酚的浸提液培养HDPSCs, 造成细胞大量死亡, 显示丁香酚有较高的细胞毒性。就同一盖髓剂而言, 虽然细胞毒性的结论类似, 但实验结果因实验条件和方法不同而没有可比性。就不同盖髓剂而言, 其理化性能相差很大, 以往的研究常常在不同条件下仅对其主要成分或有效成分进行的性能研究, 其结论相互之间也没有可比性, 对临床选择盖髓剂缺乏精细的指导。在相同条件下对不同盖髓剂开展抗菌性和生物相容性研究, 有利于临床依据不同病情选择更为精准的盖髓剂提供依据。

基于此, 本研究针对临床常用的三种盖髓剂, 即齿科氧化锌丁香酚水门汀、自固化氢氧化钙(Dycal)、光固化氢氧化钙(Calcimol), 在相同实验条件下, 系统地表征理化性质, 在相同生物环境下开展抗菌性和生物相容性的对比研究, 探讨了相关作用机理, 为体内实验提供理论依据, 并为盖髓剂的临床选择和牙髓疾病的精准治疗提供支撑。

1 实验方法

1.1 样品制备

实验用盖髓剂样品分别为: 齿科氧化锌丁香酚水门汀(ZnO, 荣祥齿科材料有限责任公司, 上海), 自固化氢氧化钙(Dycal, Dentsply, 美国)以及钙思莫光固化氢氧化钙(Calcimol, Voco, 德国)。三种盖髓剂的成分如表1所示。

按照三种盖髓剂的使用说明分别进行混合, 其中Dycal需将A和B两种组分按照1 : 1均匀混合。三种盖髓剂混合后均呈糊状, 然后采用旋涂法(5000 r/min, 30 s)将这些盖髓剂分别均匀涂抹于直径为13 mm的灭菌玻璃圆片上, 以作后续表征和对比研究。

1.2 表面形貌与成分表征

采用钨灯丝扫描电子显微镜(SEM, S-3400, Hitachi, Japan)观察ZnO、Dycal和Calcimol三种样品的表面形貌。采用能谱仪(EDS, S-3400, Hitachi, Japan)分析样品表面元素含量。采用X射线衍射仪(XRD, Rigaku, Japan)分析样品的成分和晶相, 扫描范围为5°~80°, 扫描速率为0.08 (°)/s。

1.3 表面湿润性表征

采用视频接触角仪(SL200B, 上海梭伦信息科技有限公司)测量样品接触角。将ZnO、Dycal和Calcimol分别置于样品台上, 用针头向样品表面滴加2 μL超纯水, 液滴在样品表面稳定后, 使用动静态接触角分析系统拍摄样品照片并分析各组样品的接触角大小, 以灭菌玻璃圆片作为对照组。

1.4 离子释放和pH表征

采用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES, JY2000-2, Horiba Jobin Yvon, France)测定盖髓剂中Ca离子和Zn离子的释放量。将各组样品浸泡在10 mL超纯水中, 置于37 ℃恒温培养箱内, 浸泡4 h、1 d、4 d、7 d和14 d时分别收集浸提液, 测定其中Ca离子和Zn离子的浓度。将各组样品放入24孔板, 每孔加入3 mL超纯水, 37 ℃恒温培养箱内放置3 d, 随后使用pH计(FE20-fiveEasy^TM, Mettler Toledo, Switerland)测定各组样品的pH。

1.5 抗菌性能评价

采用革兰氏阴性大肠杆菌(E. coli, ATCC25922)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus, ATCC25923)评价三种盖髓剂的抗菌性能。细菌悬液稀释至10⁷ CFU/mL备用。

1.5.1 细菌活性检测

利用阿尔玛蓝试剂盒蓝(AlamarBlueTM, AbDserotec Ltd, UK)检测盖髓剂对两种细菌培养后的活性。将三种盖髓剂样品经紫外照射2 h后置于24孔板内, 取60 μL菌液滴加在样品表面, 维持培养板湿度并置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h, 之后每孔加入阿尔玛蓝试剂500 μL, 继续培养2 h后, 使用酶标仪(ELX800, Bio-Tek, USA)检测细菌培养液在560 nm波长处激发、590 nm波长处发射的荧光强度。细菌细胞活性(Cell viability)按下式计算:

其中, FI_test为样品组的荧光强度, FI_blank为空白组的荧光强度, FI_control为对照组的荧光强度。

1.5.2 细菌菌落计数

采用细菌菌落计数法表征盖髓剂的抑菌性能。将灭菌样品放置在24孔细菌培养板, 表面分别接种60 μL浓度为10⁷ CFU/mL的细菌并置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。将样品小心夹出, 放置在灭菌离心管中, 加入生理盐水4 mL, 用振荡器震荡离心管, 将细菌从样品表面分离出来。将分离的细菌悬液倍比稀释100倍, 取100 μL稀释菌液滴加于营养琼脂培养皿, 用推棒涂匀, 倒置在37 ℃恒温培养箱中培养18 h。采用凝胶成像系统(FluorChem M, ProteinSimple, USA)对培养后的细菌琼脂培养皿拍照、计数细菌菌落数。

1.5.3 抑菌环测试

测试抑菌环用于分析盖髓剂材料抗菌性来源。将100 μL浓度为10⁷ CFU/mL的细菌均匀涂抹于营养琼脂板, 随后将各组样品倒扣(样品的盖髓剂面贴附于琼脂)在琼脂板中心, 37 ℃恒温培养18 h。利用凝胶成像系统拍照记录, 测量抑菌环。

1.6 生物相容性评价

1.6.1 细胞相容性测试

采用购买于北京三有利和泽生物科技有限公司的人牙髓干细胞(HDPHCs) (Cat No.1047D)对比评价ZnO、Dycal和Calcimol三种盖髓剂的细胞相容性。细胞培养液为添加10%胎牛血清(FBS, Gibco, USA)和1%青霉素/链霉素混合液(Hyclone, USA)的α-MEM基础培养液(Gibco, USA)。细胞培养在含有体积分数5% CO₂的37 ℃恒温培养箱中进行。

将紫外灭菌处理2 h的样品放入24孔细胞培养板, 没有旋涂盖髓剂的玻璃圆片作为对照组。使用磷酸缓冲液清洗各组样品后, 每孔滴加密度为2×10⁴ cell/mL细胞悬液1 mL, 培养3 d后, 吸去原培养液, 分别加入含有10%阿尔玛蓝染液的新鲜培养液, 按阿尔玛蓝试剂盒说明书操作, 采用酶标仪测定细胞培养液在560 nm波长处激发、590 nm波长处发射的荧光强度值。

1.6.2 血液相容性测试

采用上海交通大学附属同仁医院提供的血液进行血液相容性实验。去离子水和生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照。各组样品放入24孔板并加入1.5 mL生理盐水, 置于37 ℃恒温箱内保温30 min。将0.5 mL的生理盐水加入0.4 mL血液内并混合均匀。取稀释后的血液30 μL加入样品中继续培养60 min。对浸提液离心并取上清液, 测试上清液在545 nm处吸光度。溶血率(Hemolysis ratio)按下式计算:

其中, OD_test表示样品组的吸光度, OD_NaCl为生理盐水的吸光度, OD_H2O为超纯水的吸光度。溶血率越高, 表明血液相容性越差。

1.7 数据统计分析

上述定量实验每组均作3个或3个以上平行实验, 使用数据统计软件GraphPad Prism 7对各组数据进行分析, 结果记录为平均值±标准差。采用非配对检测方法对数据进行显著性差异分析。p<0.05表示数据存在统计学意义的显著性差异并在统计图上标记为*; p<0.01为更显著差异, 标记为**; p<0.001为极显著差异, 标记为***。

2 结果与讨论

2.1 表面理化性质

图1(a)为ZnO、Dycal和Calcimol旋涂样品的SEM形貌照片, EDS元素含量分析和结果归纳列于图1(b)。ZnO表面呈现白色的较光滑形貌, 高放大倍率下呈现相对均匀的纳米颗粒结构, 主要元素组成为C、O和Zn。Dycal和Calcimol表面相对粗糙, 表面形貌相似, 但Dycal呈淡黄色, 而Calcimol为乳白色。两者均由无规则颗粒构成, 低倍下观察可见, Calcimol的颗粒大小分布较为均匀, 而高倍下观察可见大量的孔洞结构。从EDS元素含量分析结果看, ZnO样品中主要含C、O和Zn元素, 其中Zn原子分数达到10.7%; Dycal和Calcimol中均含有大量的C、O和Ca元素, 但Dycal中还含有2.2%的Zn元素。

图 1. 样品表面形貌的SEM照片(a)及其EDS能谱分析结果(b)

Fig. 1. SEM images (a) and EDS results (b) of three samples

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图2为三种样品的XRD图谱。由图谱可见, ZnO丁香酚水门汀中的ZnO高度结晶; Dycal和Calcimol的结晶峰多, 但结晶性不强。Dycal主要成分为Ca(OH)₂和羟钙石型Ca(OH)₂, 以及少量的ZnO; Caicimol主要结晶相为Ca(OH)₂以及少量SiO₂。

图 2. 样品(a) ZnO、(b) Dycal和(c) Calcimol的XRD图谱

Fig. 2. XRD patterns of (a) ZnO, (b) Dycal and (c) Calcimol

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图3(a)为样品基底材料玻璃圆片(对照组)、ZnO、Dycal、和Calcimol四组样品的表面接触角测试结果, 表面平均接触角分别为61°、90°、75°和22°。这一结果表明, 三种临床常用盖髓剂的接触角大小依次为ZnO>Dycal>Calcimol。尽管Dycal和Calcimol组成上较为类似, 都含有Ca(OH)₂, 但其接触角具有较大差异: Calcimol表面亲水而Dycal相对疏水。浸泡于超纯水的各组盖髓剂表面溶液的pH如图3(b)所示。灭菌玻璃圆片的pH接近于生理环境, pH ~7.4; ZnO呈弱酸性, pH 6.66; Dycal由于含较大量的Ca元素及Ca(OH)₂, 其周围呈碱性, pH 9.16; 而Calcimol呈弱碱性, pH7.90, 与对照组相比变化不大。

图 3. 各组样品的表面接触角(a)和表面溶液的pH(b)

Fig. 3. (a) Surface contact angles and (b) pH of surface solution of the samples

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图4(a)所示为三组样品在超纯水中浸泡4 h、1 d、4 d、7 d和14 d后的Ca离子释放结果。对于ZnO样品, 其组分中不含Ca元素, 几乎不存在释放的Ca离子。对于Dycal和Calcimol两组样品, Ca离子释放量随浸泡时间的延长而增加。结合EDS和元素含量分析结果可知, 在三个样品中, Dycal中Ca的原子分数最高(9.1%), 其Ca离子的释放速率也最快, 特别是在浸泡初期(浸泡时间1 d内)Ca离子的释放速率极快, 例如浸泡4 h后其释放量升高到15 μg/mL; 浸泡时间1~14 d期间, 释放速率有所降低, 释放速率基本恒定(释放量随浸泡时间呈线性增长), 浸泡14 d后释放的Ca离子浓度达110 μg/mL。另一方面, 由于Calcimol样品中Ca元素的含量较低(原子分数仅为1.8%), Ca的释放速率较慢, 释放量基本上随时间呈线性增长, 14 d后的释放总量不足Dycal样品的1/10。就临床实际操作以及组成和形貌结果来说, Calcimol作为牙髓组织保护材料, 临床操作相对简单, 并且在超纯水中可维持较稳定的状态, 不会出现大量Ca离子释放问题, 其生物相容性有更好的保障。另一方面, 适量的Ca离子和碱性微环境有利于牙髓干细胞的牙本质分化, 更有利于保存活髓, 诱导牙髓细胞分化形成修复性牙本质^[13]。因此, 三种临床常用盖髓剂中, Dycal在Ca离子释放及其对牙髓的保护和形成修复性牙本质方面更有优势, 但其在临床上呈现多大程度的优势, 还需结合其引起周围酸碱变化程度作综合评价。

图 4. ZnO、Dycal和Calcimol样品在超纯水中(a)Ca和(b)Zn离子释放浓度随时间变化

Fig. 4. Immersion time dependence of (a) Ca and (b) Zn ion amounts in pure water containing ZnO, Dycal and Calcimol

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三组样品在超纯水中的Zn离子释放动力学结果如图4(b)所示。ZnO样品的Zn元素含量高达10.7%(图1(b)), Dycal样品的Zn元素含量也有2.2%, 两者主要以ZnO的形式存在。浸泡在超纯水中, ZnO盖髓剂可快速释放Zn离子, 释放Zn离子总量随浸泡时间呈类似抛物线增长, 浸泡4 h后溶液中Zn离子浓度达到25 μg/mL。随着浸泡时间延长, 其释放速率减小, Zn离子浓度逐渐趋向最大浓度。而Dycal样品仅释放少量Zn离子, Calcimol样品几乎没有Zn离子释放。文献报道, 适量浓度的Zn离子有助于维持较好的细胞相容性, 又可具备较好的抗菌作用, 但释放过量的Zn离子反而会降低细胞相容性, 甚至诱导细胞凋亡^[14]。因此, 在平衡细胞相容性和抗菌性方面, ZnO和Dycal两种盖髓剂样品具有潜在优势, 但二者的优势程度和差异仍需抗菌实验来评价。

2.2 抗菌性能

图5(a)为在各组样品上培养细菌后的细菌活性统计结果。以灭菌玻片上的细菌活性作为基准, 定义为100%活性, 三种样品上的细菌活性与100%的差值定义为抗菌效率(Antibacterial effect), 实验获得的抗菌效率平均值列于表2。AlamarBlue^TM试剂盒测试结果显示, 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增殖在三组样品中均受到显著抑制, 三组样品均展现出优异的抗菌性能, 具有一定的杀菌作用。其中ZnO盖髓剂的抗菌性能最为突出, 这可能与其含有大量ZnO而能快速释放大量Zn离子有关。

图 5. 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在样品表面培养后的抗菌性能

Fig. 5. Antibacterial ability of all samples on E.coli and S.aureus

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由图5(b)可知, 对照组琼脂板上可见大量的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌菌落。然而, ZnO和Dycal样品对应的琼脂板上均未观察到大肠杆菌菌落, Calcimol样品仅出现极少量菌落。同样, ZnO和Dycal样品对应的琼脂板上未观察到金黄色葡萄球菌菌落, 而Calcimol样品对应的琼脂板上则出现少量金黄色葡萄球菌菌落。可见, AlamarBlue^TM试剂盒测试结果与细菌涂板计数结果基本一致。图5(c)为使用各组样品培养细菌后的抑菌环照片。对照组无抑菌环出现, 而ZnO组呈现较大的抑菌环, 进一步证实ZnO盖髓剂的抗菌能力, 鉴于ZnO样品不显示碱性, 因此该结果也揭示了其抗菌性源自其释放的Zn离子。Dycal组具有明显的抑菌环, 结合其碱性性能即释放少量Zn离子的能力, 说明Dycal产生的碱性微环境和释放的少量Zn离子共同抑制了细菌的增殖。Calcimol组未出现抑菌环, 表明其抗菌性能并非来源于离子释放, 可能与其孔洞结构或其他特异性组分有关。

2.3 生物相容性

采用HDPSCs和人血液红细胞评价Dycal、ZnO和Calcimol的细胞相容性。HDPSCs在对照组和三种临床常用盖髓剂的表面培养3 d后的细胞活性检测结果如图6(a)所示。与对照组相比, ZnO样品大量释放Zn离子导致细胞难以存活, Dycal对细胞增殖有约50%的抑制作用, 这可能与其大量释放Ca离子而形成较强的碱性微环境有关^[15]。而Calcimol可以在一定程度上促进HDPSCs的增殖, 这可能与其Ca离子释放量少、只引起弱碱性和基本不释放Zn离子有关^[16]。

图 6. ZnO, Dycal和Calcimol samples样品的生物相容性

Fig. 6. Biocompatibility of ZnO, Dycal and Calcimol samples

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样品的溶血率如图6(b)所示。以溶血率可以忽略不计的玻片作为对照, ZnO样品溶血率为8.14%, 超出临床要求的5%。Dycal和Calcimol样品的溶血率仅分别为0.99%和1.42%, 较好地满足了临床需求。

3 结论

本研究对三种临床常用盖髓剂ZnO、Dycal和Calcimol的表面形貌及成份作了分析, 对其体外理化性能作了表征, 并进一步对其体外生物相容性和抗菌性能作了探讨。综合对比本研究所获实验数据, 可得出如下结论:

1) 以ZnO为主要有效成分的齿科氧化锌丁香酚, 通过持续不断释放Zn离子, 表现出优异的抗菌特性, 但释放大量Zn离子导致相容性下降而产生细胞毒性;

2) Dycal和Calcimol具有相同的有效成分Ca(OH)₂和相似的表面形貌, 但Dycal的Ca(OH)₂含量更高, 释放更多的Ca离子, 显示较强的碱性, 同时还释放少量的Zn离子; 而Calcimol仅表现出较弱的碱性, 导致Dycal具有较强的抗菌性, 而Calcimol具有较好的细胞相容性。本研究揭示的三种盖髓剂的离子释放、抗菌性、细胞和血液相容性特点, 在龋病和牙髓意外暴露等疾病的临床治疗中对盖髓剂的初步选择具有重要的参考意义。同时, 本研究结果为更精确的临床筛选提供了临床对比实验的依据。