钛内置物广泛应用于骨科, 但存在0.4%~5%的感染风险, 其主要致病菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)等^[1]。内置物感染处置困难且费用高昂, 许多研究探索利用涂层或表面改性技术赋予内置物抗感染能力。Malizos等^[2]在钛接骨板表面涂覆含抗生素凝胶后感染率为0。银离子也被广泛用于制备抗菌涂层^[3]。但抗生素存在引起细菌耐药的隐患^[4], 银则有明显细胞毒性^[5-6]。因此, 有必要研发能有效抗菌且不具有上述副作用的涂层技术。

微弧氧化(Micro-Arc Oxidation, MAO)是通过高电压引起金属表面氧化、击穿, 制备牢固结合的氧化层的表面改性技术^[7]。MAO处理的表面具有火山口样的粗糙形貌且可引入提高生物相容性的元素(如钙、磷), 被广泛应用于骨内置物^[8], 但MAO处理的钛表面不具备抗菌性。Al-Ahmad等将牛牙釉质、MAO钛种植体分别与细菌共培养后发现后者的细菌黏附显著高于前者^[9]; 他们将MAO和机械加工钛植入人体内3~5 d后, 发现前者表面形成的生物膜厚度高于后者, 显示MAO钛表面有利于微生物黏附增殖^[10]。因此, 赋予MAO表面抗菌能力具有重要临床价值。

镁是人体常量元素, 成人含约20~38 g镁, 其中60%~65%存在于硬组织。研究发现氧化镁(MgO)可诱导MC3T3-E1细胞成骨分化及上调成骨基因表达^[11-12]且具有抗菌能力^[13]。Nguyen等^[14]将纳米MgO与S. aureus等9种致病菌共培养, 发现其最低杀菌浓度(MLC90)为0.7 mg/mL。Coelho等^[15]制备了纳米MgO-羟基磷灰石复合材料, 并与3种细菌共培养24 h, 发现细菌黏附、生长均被显著抑制。可见MgO具有优良的抗菌作用。

电泳沉积是一种简单快速的涂层制备方法^[16], 已用于制备多种骨科钛表面涂层^[17]。Hickey等^[18]在聚乳酸表面电泳沉积了纳米MgO涂层, 并与革兰氏阳性菌(S. aureus、表皮葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌)共培养4 h后, 发现MgO涂覆组表面活细菌数分别下降64%~90%。MgO的抗菌性可以通过多种材料学参量加以调节, 如形貌^[19]、掺杂^[20]、氧空位^[21]等。电泳沉积是室温物理过程, 可以用于沉积各种特性的MgO而不改变其关键材料学特性。此外, 电泳也可以实现不同功能材料的共沉积, 如增强成骨性能^[22]和可生物降解性^[23]。但至今尚无研究报道采用电泳沉积方法在钛表面制备抗菌MgO涂层。本研究在MAO处理钛表面电泳沉积MgO涂层, 并比较不同沉积时间对抗菌率和细胞相容性的影响, 用以探索降低MAO钛内置物感染的有效方法。

1 实验方法

1.1 微弧氧化

纯钛板(TA2, 厚度1 mm, 宝鸡钛业)切割成40 mm×10 mm后用碳化硅砂纸打磨至15 μm(800目)。用质量分数3%氢氟酸(川东化工)、5%硝酸(广东光华)的混合酸处理1 min后去离子水超声清洗30 min, 吹干备用。将样品部分浸于电解液中(质量分数0.8%的β-甘油磷酸钠(Harveybio), 5.9%的乙酸钙(迈瑞尔生化)的去离子水溶液)作为正极; 以316不锈钢板(100 mm×10 mm)为负极, 施加350 V直流电压(顺德三阳STP-400V/200)并保持30 s。

1.2 电泳沉积

将0.25 g纳米MgO粉(30 nm, 鑫康新材料)悬浮在100 mL丙酮(川东化工)中, 超声分散30 min。将上述微弧氧化钛片浸于该悬液中作为正极, 以铂片(20 mm×20 mm, Ledonlab)为负极, 施加40 V直流电压(Keithley 2260B-80-13)并保持15、30、45或60 s^[24]; 样品相应记为MAO-MgO15、MAO-MgO30、MAO-MgO45和MAO-MgO60。

1.3 涂层表征

用X射线衍射仪(XRD, CuKα, 40 kV, 20 mA; 丹东通达TD-3500)分析样品物相; 扫描电子显微镜(SEM; 中科科仪KYKY-EM6900)及其所配能谱仪(EDS; Bruker 1048)观察样品表面形貌和元素分布; 场发射扫描电子显微镜(FE-SEM; JEOL JSM-7500F)及其所配能谱仪(Oxford X-Max 80)观察MgO粉体形貌、截面形貌和元素分布; 用浊度仪(SGZ-200AS, 上海悦丰)测量纳米MgO/丙酮悬浮液的稳定性。将沉积MgO的样品浸入3 mL 磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Solution, PBS), 在指定时间点转入含3 mL PBS的新管中; 将原PBS离心, 分离液相与游离粉末, 加入3 mL 0.1 mmol/L盐酸溶解粉末。36 h后, 将钛片取出, 用3 mL 0.1 mmol/L盐酸溶解表面残余MgO。用原子吸收光谱仪(AA-7000, Shimadzu)分析所有样品中镁浓度并换算为累积释放量; 每组3个平行样。

1.4 体外抗菌率

按ISO 22196-2011评价体外抗菌率。将S. aureus (菌株CMCC(B)26003, 南京乐诊生物)制成单菌落, 挑取至10 mL LB肉汤培养液(索莱宝生物)中, 37 ℃、180 r/min培养24 h。调整菌液浓度至1×10⁸ CFU/mL (OD=0.139)^[25], 梯度稀释至1×10⁵ CFU/mL。将样品切割成10 mm×10 mm片状, 干热灭菌(200 ℃, 1 h)后放入24孔板, 表面滴加300 μL菌液, 37 ℃下分别培养6、12或24 h; 取出后用10 mL PBS冲洗。冲洗液梯度稀释10⁶倍, 取150 μL滴在LB固体培养基(索莱宝生物)表面, 37 ℃培养24 h后观察菌落数。抗菌率=[(对照组回收菌落数-实验组回收菌落数)/对照组回收菌落数]×100％; 每组3个平行样。

1.5 细菌黏附

上述(1.4节中, 下同)共培养后的钛片经冲洗后, 以质量分数2%的戊二醛(源叶生物)固定过夜, 系列浓度的乙醇脱水后用SEM观察。本实验及后续实验的冲洗均用PBS, 每次2 mL, 每个样品冲洗 3次。

1.6 细菌活/死染色

上述共培养钛片冲洗后用细菌活力检测试剂盒(Live/Dead BacLight, Invitrogen)染色, 倒置荧光显微镜(Zeiss 1940645S)观察活、死细菌, 并计数。

1.7 细胞相容性

钛片干热灭菌后放入24孔板, 表面滴加1 mL小鼠成骨细胞(细胞株OB-6, 上海青旗生物技术)悬液(1×10⁵ cells/mL; 质量分数89% 的DMEM细胞培养液、10%的胎牛血清(均为Gibco)、1%的青霉素-链霉素-庆大霉素(上海龙田生物)), 放入培养箱(Thermo Fisher 3111GP)中1、3或5 d后每孔加入200 μL CCK-8试剂(重庆葆光生物)后再培养2 h。每孔吸取100 μL混悬液, 用酶标仪(Thermo Fisher 1410101)测量450 nm处吸光度。以加入培养基和CCK-8试剂但无细胞的孔板为空白样, 接种1 mL小鼠成骨细胞的孔板为对照样。将测得的吸光度换算为细胞相对(对照组)存活率, 每组做5个平行样。

1.8 细胞活/死染色

上述共培养钛片(1.7节)同1.6节方法处理, 并活/死染色(Live/Dead Cell Imaging Kit, Thermo Fisher)后在倒置荧光显微镜下观察。

1.9 统计学分析

数据行单因素方差分析(ANOVA, SPSS 16.0)和Tukey多重比较; p<0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 电泳沉积与涂层表征

SEM观察显示(图1(a, b)), MgO粉体由尺寸约200 nm的片状晶体构成的微米尺度的团聚体/多晶体组成。纳米MgO颗粒在丙酮溶液中超声分散30 min后在1 h内悬浮液浊度变化较小(图1(c)); 1 h后浊度加速下降。

图 1. (a, b) 纳米MgO的低、高倍SEM形貌及(c)纳米MgO/丙酮悬浊液浊度随时间的变化曲线

Fig. 1. (a, b) Low and high-power SEM images of nano-MgO powder used and (c) variation of turbidity of nano-MgO/acetone suspension with time

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采用SEM观察发现MAO钛片表面(图2(a, b))具有大量火山口状微孔, 直径2~5 μm。MAO钛在纳米MgO-丙酮悬浮液中电泳15~60 s后, MgO颗粒团聚并沉积在表面(图2(c~f)), MAO基体的火山口形貌逐步覆盖, 部分火山口内有MgO颗粒嵌入。MAO-MgO45表面几乎完全被MgO颗粒覆盖(图2(e))。EDS分析(图3(a))在所有样品表面均检测到Ti、Mg、Ca、P、O元素, 且Mg峰的相对强度随电泳时间延长。能谱面扫描发现, Mg元素完全覆盖各组样品表面且强度分布较均匀(图3(b))。

图 2. 样品的SEM表面形貌

Fig. 2. SEM images of samples

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图 3. 样品的(a) EDS谱图和(b) Mg元素面分布图

Fig. 3. (a) EDS spectra and (b) Mg mappings of samples

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FE-SEM观察样品截面发现(图4(a~d)), 各组样品在钛-树脂界面处存在过渡区, 各组过渡区内物质均呈颗粒状形貌, 难以可靠区分MgO沉积层与MAO形成的氧化物。EDS面扫描发现(图4(e~h)), Mg在过渡区中出现层状连续的特征X射线信号, 显示其为MgO沉积层。MAO-MgO15、MAO-MgO30、MAO- MgO45和MAO-MgO60的MgO厚度分别约为3、6、9、32 μm。XRD谱图显示(图5), MgO特征峰强度随电泳沉积时间延长而增强, 说明涂层厚度增加。

图 4. 样品的SEM截面形貌和Mg元素面分布

Fig. 4. Sectional SEM images and Mg mappings of samples

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图 5. 各组样品XRD谱图

Fig. 5. XRD patterns of samples

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4组样品表面Mg²⁺总量分别为284.9、323.5、698.7、823.3 μg(图6)。在PBS浸泡过程中, Mg²⁺均主要通过溶解的方式释放, MgO粉末脱落所占比例可忽略。MAO-MgO15、MAO-MgO30的Mg²⁺在6 h内几乎完全释放, 而MAO-MgO45、MAO- MgO60则在3 h内快速释放, 随后释放速率逐渐降低, 至36 h分别释放99%和87%的总Mg²⁺。

图 6. 各组样品镁离子累计释放量

Fig. 6. Cumulative release of Mg²⁺ from samples

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2.2 体外抗菌

图7(a)为各组接种细菌并培养24 h后冲洗液稀释涂板形成菌落的典型照片。电泳沉积MgO的样品形成菌落数均少于MAO样品, 且随电泳时间延长而减少。与金黄色葡萄球菌共培养6 h后，4组样品抗菌率分别为1%、69%、83%、84%，共培养24 h后分别为81%、86%、89%、98%(如图7(b)所示)。各组抗菌率随培养时间延长而提高，4组样品在24 h的抗菌率比6 h分别提高了80%、17%、6%、14%。活死染色(图8)发现MAO表面存在大量活细菌(绿色像素), 而未发现死细菌(红色像素)。其余4组样品表面死细菌所占面积均远超活细菌, 且活细菌面积随样品中沉积MgO颗粒的时间呈减少趋势。SEM观察发现接种并培养24 h后, MAO组表面覆盖分散大量球状细菌菌落(图9(a)); 其余4组表面细菌数量明显少于MAO组, 且随电泳沉积时间延长而减少 (图9(b~e))。各实验组样品表面已无明显可见的纳米MgO颗粒, 均露出MAO的火山口状微孔形貌。

图 7. (a)各组样品与细菌共培养24 h后冲洗液涂板形成菌落的典型照片及(b)共培养后的抗菌率

Fig. 7. (a) Representative photographs of colonies formed on samples after co-cultured with S. aureus for 24 h, and (b) antibacterial rates

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图 8. 各组样品与细菌共培养24 h并活/死染色后的荧光显微照片

Fig. 8. Micrographs of samples after Live/Dead fluorescent staining on co-cultured S. aureus for 24 h

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图 9. 样品接种细菌培养24 h后表面SEM形貌

Fig. 9. SEM micrographs of samples

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2.3 细胞相容性

各组样品接种小鼠成骨细胞培养1、3和7 d后, 表面细胞相对存活率随培养时间延长而上升(图10); 在同一时间点, 存活率随样品沉积MgO的时间延长而下降。培养1 d后, 4组样品存活率(相对空白孔板中所接种细胞)分别为108%、89%、53%、27%，与MAO组比较, MAO-MgO15的存活率上升2%, 而MAO-MgO30、MAO- MgO45、MAO-MgO60分别下降17%、53%和79%, 其中后两组的降低量具有统计学意义。培养5 d后, 4组样品存活率分别为139%、117%、112%、66%，与MAO组比较, MAO-MgO15、MAO-MgO30、MAO-MgO45、MAO-MgO60分别下降25%、47%、52%和98%, 其中后3组的降低具有统计学意义。按照国际标准(ISO 10993.3)的规定, 细胞相对(对照样)存活率≥70%视为无细胞毒性。因此, 培养1 d时, MAO-MgO15、MAO-MgO30无细胞毒性; 培养5 d时, 仅MAO-MgO60尚存细胞毒性(存活率66%)。活死染色(图11)结果显示, 培养5 d后, 各组样品表面均黏附大量活细胞。其中, MAO、MAO-MgO15表面仅有极少量死细胞, 而其余3组表面死细胞占比均<5%。

图 10. 细胞接种在样品表面培养1~5 d后的相对存活率

Fig. 10. Viability of rat osteoblasts after co-culture on samples for 1, 3 and 5 d

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图 11. 各组样品与细胞共培养5 d并活/死染色后的荧光显微照片

Fig. 11. Images of samples after Live/Dead fluorescent staining on co-cultured rat osteoblasts for 5 d

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3 分析讨论

本研究将纳米MgO悬浮于丙酮, 通过外加电场成功驱使MgO向负极移动、团聚-沉积于MAO钛表面。丙酮具有低黏度和高介电常数, 因此纳米MgO在丙酮中易发生电泳沉积, 且有利于提高涂层的均匀度^[24]。相较于其他MgO涂层制备方法(如溶胶-凝胶、磁控溅射), 电泳沉积技术简单快速, 且适用于复杂形状的基体^[16]。但是, 电泳沉积涂层的内聚力以及与基体的结合力主要为颗粒间的范德瓦尔斯力, 缺乏化学键合^[16]。本研究中利用MAO钛表面粗糙多孔结构相对有利于涂层形成机械结合。对于接骨板、多孔钛等内置物^[26-27], 其植入过程中不与周边骨发生强摩擦, 因此对涂层-基体结合性能要求不高。此外, Daghighi等^[28]提出, 细菌在表面可快速溶蚀的生物材料上难以稳定附着, 且可随表面脱落。本研究中, MgO涂层发生持续溶解, 其中MAO-MgO15、MAO-MgO30在约6 h内完全溶解。该溶解能否使部分细菌脱落而减少其附着于钛表面, 尚需进一步研究。

电泳沉积15~60 s的样品对金黄色葡萄球菌均具一定抗菌能力, 其中MAO-MgO60在24 h内抗菌率达98%。金黄色葡萄球菌为内置物感染首位致病菌^[1], 因此本实验结果具有临床指导意义。MgO的抗菌机制目前尚未完全确定, 其它研究认为可能包括氧自由基(ROS)产生、pH升高、直接接触等。Diaz等^[29]发现MgO对革兰氏阴性和阳性菌均有抗菌能力, 并认为其机制可以归于米MgO产生ROS(如超氧阴离子自由基和过氧化氢)并破坏细菌膜脂质。Tan等^[30]用磁控溅射在钛表面沉积了MgO涂层, 发现其抗菌性随沉积厚度而升高, 提出其抗菌机理可能源于涂层碱性干扰跨膜质子泵从而影响细菌呼吸作用。Leung等^[31]研究了3种纳米MgO对大肠杆菌的抗菌机制, 发现其中2种样品不产生ROS但仍有强抗菌性, 提示抑菌作用可能是由材料导致的细菌膜损伤。本研究中涂层的抗菌机理尚在研究中, 结果将作后续报道。

MgO涂层的细胞毒性随沉积时间延长而上升, 但随培养时间延长而下降(图10), 显示细胞毒性与MgO的剂量相关。培养后期细胞毒性下降可能与ROS释放-湮灭、MgO溶解等因素有关。已有研究报道MgO颗粒对成骨谱系细胞的增殖具有正面或中性作用^[30,32-33]。目前对MgO陶瓷块材生物相容性研究相对较少; Janning等^[34]将Mg(OH)₂植入兔股骨2~6 w后发现骨皮质增厚, 未见其它不良反应。亦有大量动物和临床研究探讨了可吸收镁合金的体内外生物相容性^[35⇓-37], 发现镁合金的降解产物仅有氢气和Mg(OH)₂, 这间接支持了MgO涂层的生物相容性。本研究未评价涂层的体内抗菌性能和对成骨性能的影响, 需进一步研究以深入认识其性能。

4 结论

本研究采用电泳沉积法将纳米MgO颗粒沉积在微弧氧化钛的表面, 成功制备了均匀的MgO涂层。沉积15~60 s制备的钛表面MgO涂层具有良好的抗菌性和生物相容性。抗菌性和细胞毒性均随沉积时间而提高, 其中沉积30 s的样品具有较好的综合性能。后续工作将研究涂层在动物模型中的抗菌及成骨性能。