1　引言

细菌感染严重危害人类身体健康，但目前临床上常用的检测手段需要进行细菌培养，操作繁琐且耗时较长，往往会耽误最佳治疗时机^［1］。因此，开发一种快速准确的细菌识别方法对及时有效治疗细菌感染具有重要意义。

拉曼光谱可以提供细菌所含不同生物分子的指纹图谱信息，如蛋白质、DNA和脂质^［2］。每种细菌都有其特定的指纹图谱信息，因此，可将拉曼光谱用于细菌种类鉴定^［1］。但细菌的拉曼信号弱、易被噪声干扰且同一菌种不同亚型的拉曼光谱差异极小、难以区分^［3］。细菌拉曼光谱分类中应用广泛的是传统机器学习方法^［4］，如：Kloβ等^［5］用支持向量机（SVM）成功实现了11种会造成尿路感染细菌的分类；史如晋等^［6］构建的集成学习模型实现了对大肠杆菌和布鲁氏菌的快速鉴定；Yan等^［7］结合核主成分分析和决策树方法实现了23种食源性致病菌的分类。传统机器学习方法对细菌的分类效果主要取决于光谱预处理策略，且只能采用尝试法寻找最佳预处理策略，效率不高^［8］。卷积神经网络（CNN）模型具有强大的特征自学习能力，可根据数据集自动提取最有利于任务的特征^［9］。如：Liu等^［10］将CNN模型用于矿物的拉曼光谱分类，结果表明，CNN模型的分类效果优于常见的传统机器学习算法；Huang等^［11］使用一维卷积网络模型成功实现了20种动物血液拉曼光谱的分类；Ho等^［12］设计出一个基于残差的一维卷积网络模型，实现了30种常见致病菌拉曼光谱的分类。

本文构建了一种基于密集连接的一维卷积网络模型Raman-net，无需额外的光谱预处理就能有效对细菌拉曼光谱进行分类。在Bacteria-ID数据集上的实验结果表明，Raman-net的分类准确率远高于传统机器学习方法且优于Ho等^［12］提出的残差网络模型。此外，对细菌表面增强拉曼光谱Raman-net也能得到较好的分类效果。

2　算法原理

2.1　Raman-net模型

2.1.1　Raman-net原理

何凯明等^［13］提出的残差网络（ResNet）在普通CNN模型中引入快捷连接（Shortcut connection），缓解了训练深层神经网络模型过程中出现的梯度消失和退化问题（Degradation problem），使深层的网络模型更易优化，从而通过增加网络模型的层数增强模型的表达能力，改善模型性能。黄高等^［14］受ResNet的启发，在普通卷积网络模型中引入更密集的快捷连接，提出了密集连接网络（DenseNet）。该模型一经提出就在MNIST、CIFAR-10和CIFAR-100等图片数据集上取得了良好的分类性能。DenseNet密集连接块内每个卷积层的特征图都和前面所有层的特征图在通道维度上拼接在一起，作为下一网络层的输入，如图1所示。密集连接块可表示为

式中：[x0,⋯,xL-1]为第0层到第L－1层特征图的拼接；HL为第L层对输入特征图的操作。DenseNet通过密集连接对特征图进行复用，既提高了特征图的利用率，又加强了模型各层间信息的有效传递。尽管拥有更多的快捷连接，但DenseNet的待学习参数量少于ResNet，使DenseNet能用更低的硬件条件取得更好的模型效果。

图 1. 密集连接块的结构

Fig. 1. Structure of the dense connection block

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受DenseNet启发，Raman-net将密集连接引入一维CNN，提高了模型对拉曼光谱特征图的利用率以及模型的准确率和鲁棒性。密集连接块内每一层仅向后层传递少量特征图，使Raman-net的待学习参数量少于普通CNN，给模型的训练和部署带来便利。

2.1.2　Raman-net模型的结构

Raman-net是一个密集连接的一维CNN模型，由一个初始卷积层（Conv）、4个密集连接块以及完全连接层等组成。Raman-net密集连接块的主体结构如图2所示。初始卷积层有64个卷积核，卷积核尺寸为1×5，步长为2，使用边缘填充。随后是一个1×3的最大池化层，步长为2，使用边缘填充。每个基本块由一个1×1卷积层和一个1×3卷积层组成，步长均为1，使用边缘填充。4个密集连接块分别由1、2、10、16个基本块组成，每个密集连接块内的基本块都使用快捷连接向其之后的基本块传递3个特征图，每两个密集连接块之间都有一个转换层，用于将上一密集连接块输出的特征图通道数压缩后传入下一密集连接块。转换层由步长为1的1×1卷积层接步长为2的1×2平均池化层组成。最后，由一个1×7平均池化层将特征图压缩后输入全连接（FC）层得出分类结果，模型最终输出细菌的种类为C.glabrata，如图3所示。

图 2. Raman-net的密集连接块

Fig. 2. Dense connection block of the Raman-net

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图 3. Raman-net模型的结构

Fig. 3. Structure of the Raman-net model

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使用预激活机制，即在模型所有卷积层之前依次设置批归一化（BN）层和线性整流单元（ReLU）激活函数。ReLU激活函数可表示为

BN的主要作用是加快模型收敛速度，同时具有一定的正则化效果。模型训练过程中，采用交叉熵作为损失函数，可表示为

式中：xi为第i个光谱样本；y_i为第i个光谱样本的标签；yi,k为将第i个样本预测成类别k；pi,k为将第i个样本预测成类别k的概率；N为样本总数；K为类别总数。

2.2　对比算法

SVM是一种线性二分类模型，其目标是在样本线性可分情况下从样本空间中寻找一个最大间隔分离超平面完成数据二分类^［15］。通过引入核函数将非线性可分的数据映射到高维空间中，进而实现对非线性可分数据的分类，再通过一对一或一对多策略实现SVM的多分类模型。

随机森林（RF）是一种优秀的并行集成学习方法，是许多决策树的集成。对集成模型而言，基学习器间的差异性越大，模型的效果就越好。由于引入了随机抽样和随机选取划分属性两个随机步骤，增大了RF模型中各决策树间的差异性，进而提升了模型的性能。RF模型不过度依赖特定样本和属性，具有较强的抗干扰能力和泛化能力^［16］。

K近邻（KNN）算法的思想是先计算待分类样本到其余各样本的距离（一般采用Minkowsky距离或Euclidean距离），然后选出距离待分类样本最近的K个样本，最后统计K个样本的类别，将待分类样本划分为K个样本中数量最多的类别。KNN算法一般适用于样本容量较大的数据集，对于样本容量较小的数据集分类效果不佳^［17］。

3　研究对象

3.1　普通拉曼光谱数据集

Ho等^［12］公开的Bacteria-ID细菌拉曼光谱数据集包含30种常见致病菌的78500条拉曼光谱，光谱范围为381.98~1792.4 cm^-1，共1000个波段，实验中使用了该数据集的reference、finetune和test子集。其中：reference子集包含了60000条拉曼光谱数据，30种致病菌各2000条；finetune和test子集各包括3000条拉曼光谱数据，30种致病菌各100条。所有拉曼光谱数据均经过归一化处理并去除基线。

3.2　表面增强拉曼光谱数据集

3.2.1　实验样本

细菌收集自徐州医科大学附属医院检验科，包含耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）和对碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌（CSKP）各10株。分离株在哥伦比亚血平板培养基上37 ℃ 过夜培养，然后用无菌去离子水制备浓度约为10⁷ mL^-1的细菌溶液。

3.2.2　实验器材及过程

根据Lee等^［18］报道的柠檬酸三钠还原法制备纳米银颗粒（质量浓度为0.1 mg/mL，颗粒粒径为40~60 nm）作为增强基底，将10 μL菌液样品与10 μL银纳米颗粒均匀混合在EP管中，孵育10 min后取4 μL混合物滴在单晶硅片上作为测量样品。测量前以硅片在520.7 cm^-1的峰为基准，对便携式拉曼光谱仪（B &W TEK，i-Raman Plus BWS465-785H）进行校准。仪器设置：用785 nm氦氖激光作为激发光源，激光功率为14 mW；20倍长聚焦物镜，积分时间为4 s，积分3次，测量范围为400~1800 cm^-1。测量中每个菌株制备10份样品，每份样品随机选择6个位点进行检测，共获得2种肺炎克雷伯菌各600条表面增强拉曼光谱。含有碳青霉烯酶是CRKP具备耐药性的最主要原因^［19］。图4为CRKP和CSKP的拉曼光谱图。两种细菌拉曼光谱的主要差异：CSKP在拉曼位移1537、1029、914、789 cm^-1处均比CRKP多一个子峰，在1220 cm^-1处CRKP的峰比CSKP更平缓。可以发现：在1537 cm^-1附近的峰被认为是C—H2键的变形^［20］；在1220 cm^-1附近的峰被认为由核酸、蛋白质和脂质引起^［21］；在1029 cm^-1附近的峰被认为由苯丙氨酸引起^［22］；在914 cm^-1附近的峰被认为由C—C键引起^［23］；在789 cm^-1附近的峰被认为由核酸引起^［21］。

图 4. CSKP和CRKP的拉曼光谱

Fig. 4. Raman spectra of CSKP and CRKP

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4　实验结果与分析

4.1　普通拉曼光谱数据集实验结果与分析

首先，用Raman-net在reference数据集上进行训练得到预训练模型。然后，将预训练模型在finetune数据集上进行微调整。最后，在test数据集上测试模型的泛化效果，得到Raman-net的分类准确率。反复尝试后设置的模型参数：1）用非线性函数ReLU作为激活函数；2）用dropout技术及早停策略降低模型的过拟合程度，drop rate为0.1；3）批处理大小为16；4）用Adam作为优化器，学习速率设置为0.001，betas设置为（0.5，0.999）；5）采用5折交叉验证方式进行模型训练。

SVM、RF和KNN模型均使用finetune数据集作为训练集，test数据集作为测试集，使用网格搜索策略寻找最佳参数组合，采用5折交叉验证方式训练模型。为避免偶然性干扰，所有实验均重复5次，取5次分类结果的平均值作为最终分类准确率，结果如表1所示。可以发现：相比SVM、RF和KNN，Raman-net的准确率分别提高了5.13个百分点、20.46个百分点和47.63个百分点；相比Ho等^［12］提出的一维CNN模型，Raman-net的准确率提高了2.26个百分点。

4.2　表面增强拉曼光谱数据集实验结果与分析

为研究数据集大小对各模型分类准确率的影响，依次从肺炎克雷伯菌表面增强拉曼光谱数据集中取每种细菌各100、200、300、400、500、600条光谱作为数据集，所有实验均将数据集随机划分80%作为训练集，20%作为测试集。无需任何光谱预处理流程，将Raman-net的预训练模型在训练集上进行训练，在测试集上测试模型的分类效果。SVM、RF和KNN模型均在训练集上训练，在测试集上得出分类准确率，使用网格搜索策略寻找最佳参数组合，采用5折交叉验证方式训练模型。为避免偶然性干扰，所有实验均重复5次，取5次分类结果的平均值作为最终分类准确率，结果如表2所示。可以发现，随着光谱数量的增加，各模型的准确率虽有小幅波动，但整体保持上升趋势，而Raman-net模型在不同数据量下均取得最高的分类准确率。尽管CRKP和CSKP的表面增强拉曼光谱极其相似且存在增强材料特征峰的干扰，Raman-net的分类准确率仍可达99.16%，显著高于传统机器学习方法。

5　结论

Raman-net无需光谱预处理就可有效分类细菌的拉曼光谱，对30种致病菌的拉曼光谱分类的准确率为84.26%，优于SVM（79.19%）、RF（63.80%）和KNN（36.63%）以及一维CNN模型。对于两种极其相似的肺炎克雷伯菌的表面增强拉曼光谱，Raman-net的识别准确率可达99.16%，显著高于传统机器学习方法。综上所述，Raman-net对细菌的普通拉曼光谱和表面增强拉曼光谱均具有优秀的分类性能且无需光谱预处理，为细菌的拉曼光谱分类提供了一种快速有效的手段。