1　引言

酸碱度是生物医学、临床分析、食品安全和环境工程等领域的重要测量参数，对其进行准确、快捷的测定在实际应用中尤为重要^[1-3]。目前基于荧光分析方法的生物检测技术因为响应速度快、空间分辨率高、操作简单等优点常被应用于pH检测^[4-6]。荧光pH传感器通常由对pH敏感的荧光探针、载体薄膜和固定基质组成。在检测过程中，待测分析物透过薄膜与荧光传感探针发生相互作用，通过分析荧光探针光学信号变化来检测pH变化^[7-9]。目前常用的pH荧光探针主要有荧光素及其衍生物^[10-11]、萘酰亚胺类衍生物^[12]和1-羟基-3，6, 8-芘三磺酸（HPTS）^[13-15]等。其中，HPTS是一种应用广泛的水溶性pH指示剂染料，水溶液中pKa约为7.3，具有绿光波段发射，且拥有两种具有不同pH依赖性的激发带^[13]，分别对应于质子化（酸性，405 nm左右）模式及去质子化（碱性，460 nm左右）模式，这两种激发带有利于进行比率荧光测量。目前，将pH敏感的荧光探针与纳米材料、有机物膜、光纤等基质结合制作的荧光传感器得到了广泛的关注^[16-17]。石英毛细管在材料方面与光纤具有结构一致性，由中空部分和石英管壁等组成，常被用于制作整体结构简单、稳定性好、灵敏度高的传感器件^[18-20]。此外，石英毛细管可同时实现液体传输和光线传输双重功能，其不仅可有效减少样品的用量，而且因将荧光探针分子固定于毛细管的内壁，在管壁的保护下性能更稳定。近年来利用毛细管作为固定基质的荧光pH传感器逐渐应用于酸碱度监测^[21]，然而，基于单一荧光强度的检测方式常受到探针浓度、激发光强度和探测器波动等因素影响。引入参比荧光的比率检测方法可避免各种外部因素对测试数据的影响，进而有效提高检测精度^[15,22-23]。但是，目前围绕比率型荧光毛细管传感器的pH检测工作尚未见报道，因此亟需发展精准稳定的比率荧光毛细管pH传感器以便开展方便灵活的pH监测分析。

本文利用溶胶-凝胶法制备了以HPTS作为荧光探针的石英毛细管比率pH传感器。首先将HPTS与CTAB结合形成HPTS-IP离子对，然后将其均匀分散于ETEOS和GPTMS的溶胶混合样品中，并将其涂抹于毛细管内壁，加热干燥后在毛细管内壁成功固定包覆HPTS的溶胶-凝胶薄膜，即制得比率荧光毛细管pH传感器。HPTS在405 nm和460 nm分别激发下的荧光信号具有不同的pH响应，二者的荧光强度比率具有较强的pH敏感性，根据毛细管传感器的比率荧光信号变化可有效检测pH值变化，进而在生物医学和环境保护领域的pH监测与分析方面具有巨大潜力。

2　实验

2.1　试剂与仪器

试剂：8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙基三乙氧基硅烷（ETEOS）、（3-缩水甘油氧丙基）三甲氧基硅烷（GPTMS）和1-甲基咪唑（MI）购自麦克林化学试剂有限公司。无水乙醇和盐酸购自国药集团化学试剂有限公司。在实验过程中均使用去离子水，所有化学试剂未进行处理。

仪器：利用Hitachi S-4800扫描电子显微镜表征毛细管内壁薄膜形貌（SEM），通过Hitachi F-4600 荧光分光光度计测试比率荧光毛细管传感器的激发和发射光谱。

2.2　负载pH敏感薄膜的毛细管传感器制备方法与步骤

第一步合成HPTS-IP离子对，在50 ℃条件下，将0.76 mmol的CTAB溶解在25 mL的去离子水中，随后，将0.38 mmol HPTS溶解在25 mL去离子水中，并加入到CTAB溶液中合成离子对。然后将离子对沉淀（HPTS-IP）过滤并在烘箱中干燥，并将样品溶于乙醇中备用。第二步制备基于ETEOS的溶胶，将ETEOS、0.1 mol·L^-1盐酸水溶液和乙醇按1∶0.007∶6.25的量比混合。第三步制备基于GPTMS的溶胶，以GPTMS、MI、去离子水和乙醇为原料，配制1∶0.69∶4∶6.25量比混合溶液。最后将上述第二步和第三步的两种溶胶以等量比混合后，与HPTS-IP乙醇溶液以1 000∶1的溶胶染料比混合，搅拌均匀后涂抹于毛细管内壁，在140 ℃条件下加热4 h，即制得负载pH敏感薄膜的毛细管传感器。

3　结果与讨论

3.1　比率荧光毛细管pH传感器的构建和表征

基于HPTS的比率荧光毛细管pH传感器通过溶胶-凝胶法制备^[13,21,24]，将基于ETEOS和基于GPTMS的两种溶胶与HPTS-IP混合后涂抹于毛细管内壁，干燥后在毛细管内壁成功负载pH敏感的溶胶-凝胶薄膜，即制得比率荧光毛细管pH传感器。由于HPTS-IP离子对疏水性强于HPTS，因此可减少HPTS在待测液中的浸出。

比率荧光毛细管pH传感器示意图和实物照片如图1（a）所示，黄绿色部分为固定于毛细管内壁的负载HPTS染料的溶胶-凝胶薄膜，该薄膜无明显的裂缝，厚度较为均匀。通过扫描电镜对毛细管传感膜的剖面进行成像（图1（b）黄色标框区域），结果表明该传感膜表面致密、光滑且比较均匀。HPTS的激发光谱如图2（a）中虚线所示，其拥有两种具有不同pH依赖性的激发带^[13]，分别位于405 nm左右和460 nm左右。HPTS的发射光谱如图2（a）中实线所示，其仅拥有单个发射带，在513 nm左右具有较强的发射峰。当环境pH值由5上升至8时，460 nm和405 nm左右的激发峰位置未发生明显变化（图2（b）），在405 nm和460 nm光激发下，传感器的发射光谱峰值位置未发生变化（图2（c））。HPTS的双激发峰为基于参比激发模式的比率荧光pH检测提供了条件。利用该传感器进行pH检测时，待测溶液可与毛细管内壁的传感膜充分发生反应，并最终通过光谱仪检测到荧光信号变化，根据荧光信号可有效地分析pH值变化。

图 1. （a）比率荧光毛细管pH传感器的结构示意图，右上角插图为实物照片；（b）pH传感膜的SEM图像，标尺20 µm

Fig. 1. （a）Schematic illustration of ratiometric fluorescent capillary sensor. The inset is photo image. （b）SEM image of pH sensing film， scale bar： 20 µm

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图 2. （a）HPTS的激发光谱（虚线，λ_em =513 nm）和发射光谱（实线，λ_ex=460 nm）；（b）pH为5和8时，比率荧光毛细管传感器的激发光谱（λ_em=513 nm）；（c）在405 nm和460 nm光激发下，传感器的发射光谱

Fig. 2. （a）Excitation spectra（dashed lines，λ_em=513 nm） and emission spectra（solid lines，λ_ex=460 nm） of HPTS loaded on the capillary sensor. （b）Excitation spectra of capillary sensor in different pH concentrations（λ_em =513 nm）. （c）Emission spectra of capillary sensor under excitation at 405 nm and 460 nm

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3.2　比率荧光毛细管传感器的pH敏感性

为分析比率荧光毛细管传感器的pH敏感特性，我们利用荧光光谱仪依次表征该毛细管传感器在pH值为5.0，6.0，6.6，7.0，7.4，8.0的缓冲溶液中的发射光谱变化。在405 nm激发光作用下，该毛细管传感器的发射光谱如图3（a）所示。当缓冲溶液的pH由5.0上升至7.0时，传感器的荧光发射强度随环境pH值的上升而逐渐升高；当pH从7.0上升至 8.0时，荧光强度又略微下降，可能是由于激光辐照时间增加影响光稳定性所致。在460 nm激发光作用下，该毛细管传感器的发射光谱如图3（b）所示。随着缓冲溶液的pH由5.0上升至7.0，传感器的荧光发射强度逐渐升高；而当pH从7.0上升至8.0时，荧光强度则略微下降，该现象也归因于激光辐照时间增加影响荧光探针的发光强度。取图3（a）和图3（b）在513 nm处的发光强度之比进行比率荧光分析（图4），发现从pH=5.0上升至pH=8.0时，比率荧光强度大约升高2.6倍。将比率荧光信号与不同pH进行Sigmoidal曲线拟合^[25]，pKa值为6.95，拟合度（R²）为0.99。以上实验结果表明，该比率荧光毛细管传感器具有较好的pH敏感性，可有效避免单一荧光强度检测所受的长时间激光辐照影响，基于HPTS在双激发带下的发射强度比值变化可实现对pH的灵敏检测。

图 3. 在405 nm（a）和460 nm（b）光激发下，比率荧光毛细管传感器在不同pH值环境中的发射光谱

Fig. 3. Emission spectra of capillary sensor in different pH concentrations under excitation at 405 nm（a） and 460 nm（b）

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图 4. 图3（b）与3（a）中513 nm处荧光强度的比率在不同pH环境下的响应拟合曲线

Fig. 4. Sigmoidal fitting plot of fluorescence intensity ratios of Fig.3（b） and Fig.3（a） at 513 nm

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3.3　比率荧光毛细管传感器的稳定性和可逆性

传感器件的良好稳定性是实际应用的基本要求。为分析比率荧光毛细管pH传感器的稳定性，我们将制得的毛细管传感器在避光的条件下储存，分别在第0，2，4，6，8，10，40，42，44，46 d监测其荧光发射光谱变化。图5（a）是取不同储存时间发射光谱的比率荧光信号绘制的时间-比率荧光强度相关曲线，图中表明该传感器的比率荧光强度随时间延长未发生明显改变，在储存46 d后依然具有较稳定的比率荧光信号，证明该传感器具有较好的稳定性。此外，我们进一步分析了比率荧光传感器在水溶液中的稳定性（图5（b））和在光源辐照下的稳定性（图5（c））。如图5（b）所示，在75 min时间内，比率信号未发生明显变化，证明该传感器在水溶液中具有较好的稳定性。如图5（c）所示，在光源辐照90 min后，比率荧光信号几乎不变，证明该传感器在光源辐照下具有较好的稳定性。该传感器良好的稳定性能主要取决于荧光染料HPTS-IP离子对与溶胶-凝胶基质的共价结合、石英毛细管较好的固定作用以及比率荧光的检测方式。

图 5. 比率荧光毛细管pH传感器的稳定性研究。 （a）贮存46 d后的稳定性；（b）在水溶液中贮存75 min后的稳定性；（c）光源辐照后的稳定性

Fig. 5. Stability of ratiometric fluorescent capillary sensor stored for 46 d（a）， stored in aqueous solution for 75 min（b） and after irradiation by 460 nm light（c）

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传感器的可逆性是可重复监测的重要依据。为分析该比率荧光毛细管pH传感器的可逆性，将毛细管传感器多次交替放入pH=5.0和pH=8.0的缓冲溶液中，然后测试该传感器的比率荧光信号强度变化。如图6所示，取513 nm处的荧光发射强度比值，分析其随测量环境pH改变的波动情况。当环境pH 在5.0和8.0之间交替变化时，传感器的比率荧光强度具有较好的可重复性。实验结果表明，该比率荧光毛细管pH 传感器拥有良好的可逆性，便于多次重复进行pH监测。

图 6. 毛细管传感器比率荧光信号对pH响应的可逆性

Fig. 6. Reversibility of the responsiveness of capillary sensor to pH changes

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4　结论

本文通过溶胶-凝胶法制备了一种比率荧光毛细管pH传感器，该传感器以HPTS作为pH敏感的荧光探针，在毛细管内壁固定含有HPTS的溶胶-凝胶薄膜。该传感器在460 nm和405 nm激发光分别作用下的荧光发射峰强度比值具有较高的pH灵敏度，当pH从5.0升至8.0时，比率荧光信号增强大约2.6倍，pKa值为6.95。该比率荧光毛细管pH传感器具有良好的稳定性、高的pH敏感性、较好的可逆性和便携性，在环境科学和生物医学领域的pH监测分析方面拥有广泛的应用前景。

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