随着人们对光和光-物质相互作用的物理本质了解得越来越深入, “生物医学光学”逐渐成为一个新兴领域。光学治疗的快速发展催生了包括光热治疗、光动力学治疗策略在内的肿瘤治疗手段。其中光动力学治疗的三要素为光敏剂、一定波长的激光刺激和组织氧。光动力学治疗可利用光化学反应产生的单线态氧(¹O₂)等活性氧(Reactive oxygen species, ROS)杀死肿瘤细胞, 具有更小的侵入性、更低的副作用和更弱的耐药性等优势^[1,2,3]。光热治疗则是利用光热剂(Photothermal agent)将光能转化为热能, 产生局部加热效果而消融血管化微环境较差的肿瘤。光学治疗可以通过改变辐照部位、持续时间和激光功率密度而精确控制治疗组织范围、时间和功效, 实现辐照区域可控, 确保更低的副作用和更好的能量聚集, 从而产生显著的疗效。但是, 单一模式的光学治疗不能完全消除顽固性肿瘤, 仍有肿瘤复发或转移的风险。因此, 有必要探索设计包含至少一种光学治疗方法的联合治疗策略。

在众多光敏剂和光热剂中, 拥有超薄结构的二维(2D)纳米材料以其自身优异的光学特性、高比表面积和独特的表面化学性质^[4,5,6,7,8]等特点, 在光学治疗中显示出巨大的潜力。成功剥离石墨烯是2D纳米材料研究史上的一个里程碑^[9], 由此开启了大量2D纳米材料的探索。如2D过渡金属碳化物、氮化物和碳氮化物(MXenes)^[10]、黑磷(BP)纳米片^[11]、过渡金属二硫族元素化合物(TMDs)^[12]等, 并有一系列2D纳米材料应用于多功能纳米诊疗平台。最近, 一类新型的金属磷三硫族元素化合物(MPX₃, 其中M=Fe、Mn、Ni等, X=S或Se) 2D材料受到关注。MPX₃具有范德华层状结构, 面内刚度(60~120 N∙m^-1)略高于石墨烯, 裂解能(0.29~0.54 J∙m^-2)则略低于石墨烯, 易于从块状MPX₃剥离得到相应的纳米片(Nanosheets, NSs)^[13,14,15]。Zhang等^[13]采用理论计算得到的2D MnPSe₃单层在室温下的载流子迁移率(625.9 cm²∙V^-1∙s^-1)高于其他典型的2D材料, 表明光催化过程中电子-空穴复合的可能性降低, 且理论推测其导带和价带能级的位置跨越了水的氧化还原电势, 有利于进行光催化水分解反应。Du等^[16]发现块状MPX₃的带隙范围为1.3~3.5 eV, 恰可满足光催化剂的可设计性, 能在光催化过程中更有效地利用可见光。虽然MPX₃纳米材料的生物医学应用研究才刚刚起步, 但已展现出巨大的应用潜力^[17,18]。

Zhang等^[17]基于FePS₃纳米片构建的纳米平台可用于光热和化学动力学协同治疗肿瘤。Fang等^[18]在FePSe₃纳米片外包裹癌细胞膜, 将其作为靶向癌细胞的高效光热剂, 可联合免疫治疗, 进一步促进细胞程序性死亡, 从而显著延长实验小鼠寿命。但FePS₃纳米片的光学治疗特性还有待探索。

本研究采用高温固相法合成了一种金属磷三硫族元素化合物FePS₃块体, 并通过超声辅助的液相剥离法制备了FePS₃纳米片(FePS₃ NSs)。利用其在宽波长范围内的高效光吸收, 将其作为光热剂和光敏剂, 构建具有光热治疗和光动力学治疗双功能的联合治疗纳米体系, 即通过高热引发细胞坏死和引入ROS诱导细胞凋亡两种途径, 高效治疗肿瘤。

1 实验方法

1.1 试剂

铁(≥99%)、块状红磷(99.999%)、硫(≥99.99%)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO, ≥98.0%)和2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP, ≥99%)、N-甲基吡咯烷酮(NMP,≥99.0%)和1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF, 97%)均购自默克化工技术(上海)有限公司。硫辛酸-聚乙二醇聚合物(LA-PEG, MW:5000)购自上海亚亦生物科技有限公司。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青链霉素混合液、磷酸盐缓冲液(PBS)、Cell Counting Kit-8(CCK-8 试剂盒)和胰酶均购自上海润成生物有限公司。Calcein-AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、活性氧检测试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 FePS₃ NSs的制备及聚乙二醇修饰

首先参照文献报道的高温固相合成法^[15]制备FePS₃块体。将对应于5 g FePS₃化学计量比的铁(Fe)、红磷(P)和硫(S)放置于石英玻璃管中, 用真空泵将管内抽真空后, 使用氢氧焰焊机加热卡在管中部的石英块, 使石英块与石英管壁相熔, 冷却后实现密封。密封管在马弗炉中加热至700 ℃并保温6 d, 得到FePS₃块体。接着将块状FePS₃置于石英研钵中充分研磨得到FePS₃粉末。取FePS₃粉末(0.3 g)置于80 mL NMP中超声处理(600 W, 50 h)后离心(3000 r/min, 30 min)去掉未剥离的大块材料, 最终得到含有大量FePS₃ 纳米片的悬浮液。为获得良好的生物相容性, 选用LA-PEG^[19]对FePS₃ NSs作进一步修饰, 即将FePS₃ NSs (20 mg)和LA-PEG (60 mg)混合, 分散于去离子水中, 经30 min超声分散后磁性搅拌过夜, 最后离心并用去离子水洗涤数次, 以去掉多余的LA-PEG, 得到PEG修饰的FePS₃ NSs(FePS₃-PEG)。

1.3 光动力学效应测试

活性氧检测试剂DPBF可以与¹O₂发生Diels- Alder 1,4-环加成反应, 导致其在410 nm处的光吸收强度降低, 因此DPBF可作为¹O₂探针用以检测¹O₂。首先将含有FePS₃ NSs(50 μg/mL)和DPBF的混合液在黑暗中静置1 h以达到吸附/解吸附的平衡状态。随后用波长为660 nm且功率密度为0.5 W/cm²的激光辐照该混合液(3 mL), 在不同时间点通过UV-Vis-NIR光谱仪(HORIBA FluoroMAX-4, France)测定410 nm处的吸光度。另外, 利用电子自旋共振(ESR)光谱仪(Bruker EMX-8/2.7)检测¹O₂的产生, 将含有¹O₂捕获剂TEMP的FePS₃ NSs悬浮液(50 μg/mL)暴露于激光(660 nm, 0.5 W/cm²)下辐照10 min, 然后将混合物迅速转移至标准毛细管中, 并立即记录ESR光谱。同样地, 使用羟自由基(∙OH)或超氧阴离子(O₂^•-)捕获剂DMPO, 对比监测FePS₃ NSs是否诱导产生其他自由基。

1.4 光热性能测试

利用Fotric-225热红外成像仪记录不同条件下FePS₃ NSs悬浮液的温度变化: (1)用1064 nm (1 W/cm²)激光分别辐照不同浓度(0、25、50、100、200和300 μg/mL)的FePS₃ NSs 10 min; (2)用不同激光功率密度的1064 nm激光(0.5、1、1.5、2 W/cm²)分别辐照FePS₃ NSs(150 μg/mL)10 min; (3)用激光功率密度为1 W/cm²的1064 nm激光辐照浓度为150 μg/mL的FePS₃ NSs并进行5次激光“开-关”循环辐照(共50 min)。另根据文献[20]报道的方法计算得到FePS₃ NSs(150 μg/mL)在1064 nm光波(1 W/cm²)处的激光光热转换系数。

1.5 细胞毒性测试

CCK-8试剂盒中的水溶性四唑盐可与活细胞中的脱氢酶发生氧化还原反应, 生成橙黄色甲瓒化合物且生成量与活细胞数量成正比。因此, 可利用酶标仪读取此化合物的吸光度来计算细胞存活率。将分散在100 μL培养基中的1×10⁴ 4T1小鼠乳腺癌细胞(购自ATCC)接种到96孔板中培养12 h, 待细胞贴壁后再分别与不同浓度的FePS₃-PEG (0、15、30、60、90、120 μg/mL)共孵育12和24 h。随后用溶解在DMEM培养基中的CCK-8替代含有材料的培养基以检测细胞毒性。

1.6 FePS₃-PEG的体外抗肿瘤作用

FePS₃-PEG的光热消融肿瘤细胞效果: 将4T1细胞(1×10⁴/孔)接种到96孔板中, 待细胞贴壁后分别与不同浓度的FePS₃-PEG (0、25、50、100 μg/mL)共孵育4 h以待材料被细胞内吞, 接着用1064 nm 激光(1 W/cm²)辐照各孔细胞10 min, 过夜培养后用CCK-8试剂盒方法评估细胞活力。

FePS₃-PEG的光动力学治疗抑制肿瘤细胞效果: 将4T1细胞(1×10⁴/孔)接种到96孔板中, 待细胞贴壁后与不同浓度的FePS₃-PEG (0、25、50、100 μg/mL)共孵育4 h, 随后用660 nm激光(0.5 W/cm²)辐照各孔细胞10 min, 过夜培养后用CCK-8试剂盒方法测定细胞活力。

FePS₃-PEG的光热和光动力学联合治疗效果: 利用Calcein-AM(钙黄绿素)和PI(碘化丙啶)两种荧光探针可分别检测细胞内酯酶活性和细胞膜完整性, 从而评价细胞活性与毒性。4T1细胞(4×10⁵/皿)在共聚焦皿(底面孔ϕ14 mm)中培养贴壁后, 根据以下分组作不同处理: (1)空白、(2) FePS₃-PEG、(3) 1064 nm、(4) 660 nm、(5) FePS₃-PEG+1064 nm、(6) FePS₃-PEG+660 nm和(7) FePS₃-PEG+1064 nm+ 660 nm。其中(3)和(5)组用功率密度0.5 W/cm²的660 nm激光辐照10 min; (4)和(6)组用功率密度为1 W/cm²的1064 nm激光辐照10 min; (7)组则用660 nm (0.5 W/cm², 10 min)和1064 nm (1 W/cm², 10 min)激光先后辐照。最后经Calcein-AM和PI 染色15 min, 用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察评估细胞状态(观察活细胞: 激发光波长488 nm, 发射光波长515 nm; 观察死细胞: 激发光波长535 nm, 发射光波长617 nm)。

1.7 细胞内活性氧检测

细胞内的ROS可将被胞吞入细胞内的无荧光的2,7-二氯荧光素双乙酸酯(DCFH-DA)氧化为有荧光的2,7-二氯荧光素, 从而通过荧光来检测ROS水平。将4T1细胞(4×10⁵/皿)接种在共聚焦皿(底面孔ϕ14 mm)内培养, 分组为: (1)空白、(2) FePS₃-PEG、(3) 1064 nm (1 W/cm², 10 min)、(4) 660 nm (0.5 W/cm², 10 min)、(5) FePS₃-PEG+1064 nm (1 W/cm², 10 min)、(6) FePS₃-PEG+660 nm (0.5 W/cm², 10 min)和(7) FePS₃-PEG+1064 nm (1 W/cm², 10 min)+660 nm (0.5 W/cm², 10 min)。待细胞贴壁后将(2)、(5)、(6)、(7)组与材料共孵育4 h, 之后所有组用DCFH-DA染色30 min再进行光照刺激, 最后在CLSM下观察ROS的生成情况(激发光波长480 nm, 发射光波长525 nm)。

1.8 细胞内线粒体膜电位变化检测

JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1, 1’, 3,3’-tetraethyl- benzimidazolyl-carbocyanine iodide)分子会在膜电位较高的线粒体基质内形成发红色荧光的聚合物, 在相反情况下以发绿色荧光的单体形式存在, 由此可捕捉到细胞早期凋亡的标志之一: 线粒体膜电位下降。先在共聚焦皿(底面孔ϕ14 mm)内培养4T1细胞(4×10⁵/皿)至其贴壁, 根据分组对细胞进行相应处理: (1)空白、(2) FePS₃-PEG、(3) 1064 nm (1 W/cm², 10 min)、(4) 660 nm (0.5 W/cm², 10 min)、(5) FePS₃-PEG+1064 nm (1 W/cm², 10 min)、(6) FePS₃-PEG+660 nm (0.5 W/cm², 10 min)和(7) FePS₃-PEG+1064 nm (1 W/cm², 10 min)+660 nm (0.5 W/cm², 10 min)。即(2)、(5)、(6)、(7)组与FePS₃-PEG共孵育4 h后, 用660 nm激光辐照(4)和(6)组; (3)和(5)组用1064 nm激光辐照; (7)组用两种波长激光先后辐照。随后对所有组的细胞作JC-1染色30 min, 最后用CLSM观察线粒体膜电位变化(激发光波长480 nm, 发射光波长525 nm)。

2 结果与讨论

2.1 FePS₃ NSs的制备与表征

采用文献报道的高温固相合成法一步煅烧各元素粉末得到大块的FePS₃晶体^[15]。通过XRD分析可知(图1(a)), 所得FePS₃固体的各衍射峰与FePS₃标准卡片(PDF#30-0663)基本一致, 2θ=13.8°和27.8°处的强衍射峰分别对应于FePS₃晶体的(001)和(002)晶面, 表明本实验成功合成了具有较高相纯度的结晶FePS₃块体。从FePS₃块体的扫描电镜(SEM)照片(图1(b))可观察到独特的层状堆叠结构, 说明该材料具有从块体剥离得到相应纳米片的可能。

图 1. FePS₃块体的X射线衍射图谱(a)和扫描电镜照片(b)

Fig. 1. XRD pattern (a) and SEM image (b) of bulk FePS₃

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进一步地, 采用超声辅助液相剥离法^[21]对高温合成的FePS₃块体进行剥离, 得到FePS₃ NSs (图2(a))。动态光散射测得LA-PEG修饰前后的纳米片平均水合粒径分别为153 (图2(b))和176 nm (图2(c))。LA修饰的PEG (LA-PEG)在PEG末端具有一个二硫基,通过硫醇反应可功能化过渡金属硫化物^[22]。将PEG修饰后的FePS₃-PEG分别分散于PBS和细胞培养液DMEM中, 24 h后材料未出现明显聚集沉降(图2(c)插图), 说明其在PBS和DMEM中具有良好的分散性, 有利于提高其细胞相容性。

图 2. FePS₃ NSs的透射电镜照片(a), PEG修饰前(b)和修饰后(c)的平均水合粒径及其分散于PBS和DMEM中的照片(插图)

Fig. 2. TEM image (a) of FePS₃ nanosheets (NSs) and hydrodynamic size of FePS₃ nanosheets (NSs) before (b) and after (c) PEGylation with inset showing the picture of FePS₃-PEG dispersed in PBS and in DMEM

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2.2 FePS₃ NSs的光动力学效应

FePS₃ NSs的UV-Vis-NIR漫反射光谱及相应的Tauc图(图3和插图)。根据Kubelka-Munk理论, 吸收系数(α)可以通过测量漫反射率(图3)并代入Kubelka- Munk函数(F(R))计算获得^[23], 因为FePS₃是一种间接带隙半导体, 将(αhv)^1/2设为Tauc图的Y轴^[24]。由Tauc图中切线与X轴(hν)的截距, 估算得到该FePS₃ NSs的带隙值(E_g)为1.17 eV^[25] (图3插图), 说明 λ≤1059 nm的激光可满足其电子跃迁到激发态所需要吸收的光子能量。

图 3. FePS₃ NSs的 UV-Vis-NIR漫反射光谱和估算的带隙电势(插图)

Fig. 3. UV-Vis-NIR diffuse reflectance spectrum of FePS₃ NSs with inset showing the estimated band gap potential

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FePS₃ NS在600~800 nm范围内具有较强的光吸收性能, 且在该范围内的光穿透深度可达4~ 8 mm^[26], 同时光的波长仍然具有足够的能量以产生单线态氧^[27]。因此, 该FePS₃ NSs可以通过660 nm激光辐照获取分离的光致电子来实现电子-空穴的空间分离, 而该电子可以与环境中的O₂反应生成ROS^[28]。

以DPBF作为探针检测混合液中FePS₃ NSs受激光激发O₂生成¹O₂的情况。如图4(a)所示, 存在FePS₃ NSs时, 经过660 nm激光(0.5 W/cm²)辐照, 410 nm处的吸光度随辐照时间延长而不断衰减, 这表明DPBF被生成的¹O₂氧化。此现象与仅含DPBF的溶液形成鲜明对比(图4(b)), 其特征峰吸光度在激光辐照下变化微弱。

图 4. 660 nm激光照射下FePS₃ NSs与DPBF的混合液(a)和纯DPBF溶液(b)的紫外-可见吸收光谱, 以及不同反应体系的ESR光谱图(c)

Fig. 4. UV-Vis absorption spectra of the mixture solution of FePS₃ NSs mixed with DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran) (a) and DPBF solution (b) under 660 nm laser irradiation, and ESR spectra of different reaction systems (c)TEMP: a reagent used to detect ¹O₂. DMPO: a reagent used to detect O₂^•- and ∙OH

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另外, 为获得在660 nm激光辐照下由FePS₃ NSs产生ROS的直接证据, 本研究还作了电子自旋共振光谱分析。将TEMP和DMPO分别用作¹O₂和∙OH(或O₂^•-)捕获剂。只有在激光辐照下才能观察到具有1 : 1 : 1的三重态光谱的¹O₂信号特征, 但未检测到∙OH和O₂^•-信号(图4(c)), 表明FePS₃ NSs可将光诱导的能量从其自身(光敏剂)转移到基态氧(³O₂), 并产生具有细胞毒性的¹O₂^[29]。

2.3 FePS₃ NSs的光热性能

不同浓度FePS₃ NSs的Vis-NIR吸收光谱图 显出该材料在近红外一区(750~1000 nm)和二区(1000~1200 nm)有较强的光吸收能力, 如图5(a) 所示。

图 5. 不同浓度FePS₃ NSs的可见-近红外吸收光谱图(a), 不同浓度(b)和不同激光功率密度(1064 nm激光)(c)条件下FePS₃ NSs随时间的光热升温曲线, 以及FePS₃ NSs 5次激光开闭循环辐照的温度曲线(d)

Fig. 5. Vis-NIR spectra of FePS₃ NSs with different concentrations (a), photothermal heating curves for different time at different concentrations (b), and different laser power densities (1064 nm laser) (c), and photothermal curve of FePS₃ NSs under 5 cycles of laser “on-off” (d)

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由于近红外二区激光具有更低的人体组织背景和更弱的光子散射, 在光热治疗中能产生更有效的组织穿透效果^[30,31], 且具有更高的激光最大允许曝光量(Maximum permissible exposure)。又因FePS₃ NSs在近红外二区生物耐受剂量范围中具有优异的光吸收能力, 本研究评估了其在1064 nm处的光热转换性能。

首先, 在1064 nm波长的激光辐照下, FePS₃ NSs表现出随材料浓度或激光功率密度增加而显著增强的升温效果(图5(b, c))。在1064 nm激光(1 W/cm²)辐照10 min时, FePS₃ NSs悬浮液(300 μg/mL)的温度升高了21 ℃, 而在相同的激光功率密度下, 去离子水只观察到微弱的升温现象。通过增大辐射功率密度可增强光热性能(图5(c)), 进一步证明了该纳米片在光热转化中的可调节能力。另外, 用热红外成像仪实时记录的红外热成像图也直观地呈现了不同浓度FePS₃ NSs在1064 nm激光(1 W/cm²)辐照10 min内的产热能力(图6)。

图 6. 不同浓度FePS₃ NSs 在1064 nm激光照射下随时间升温的红外热成像照片

Fig. 6. Thermal images of different concentrations of FePS₃ nanosheets heated by 1064 nm laser irradiation for different time

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此外, 如图5(d)所示, 在5次激光开/关辐照循环中观察到FePS₃ NSs的温度变化情况基本相同, 且升温能力并未逐渐减弱, 证明FePS₃ NSs具有良好的光热稳定性。如图7所示, 根据兰伯特-比尔定律计算, FePS₃ NSs在1064 nm光波处的消光系数(ε)为38.68 L∙g^-1∙cm^-1 (图7(a))^[20], 显著高于氧化石墨烯(GO)纳米片(3.6 L∙g^-1∙cm^-1)^[32]和WS₂纳米片(23.8 L∙g^-1∙cm^-1)^[19], 表明FePS₃ NSs具有较强的近红外激光吸收性能, 可用作光热转换的理想光热剂。随后, 根据传热时间常数τ_s=138.04 (图7(b))和最高稳态温度计算, FePS₃ NSs的光热转换效率(η)为19.7% (图7(c)), 高于已有报道的铜纳米线(12.5%)^[33]和金纳米壳(13%)^[34]。

图 7. FePS₃ NSs 在λ=1064 nm处的归一化吸收强度除以相应浓度下样品特征长度(A/L)与相应浓度的线性拟合曲线(a), FePS₃ NSs经1064 nm激光辐照后冷却过程的-lnθ与时间的线性关系(b), FePS₃ NSs在1064 nm激光辐照下的升温和冷却曲线及冷却过程的-lnθ与时间的线性关系(c)

Fig. 7. Linear fitting curve between normalized absorption intensity of FePS₃ NSs at λ=1064 nm divided by the characteristic length of the sample at corresponding concentration (A/L) and the corresponding concentration (a), linear relationship between -lnθ and time of cooling process of FePS₃ NSs after 1064 nm laser irradiation (b), heating and cooling curves of FePS₃ NSs under 1064 nm laser irradiation, and linear relationship between -lnθ and time of the cooling process (c) ε, τ_s and η represent extinction coefficient, time constant in cooling stage, and photothermal conversion efficiency, respectively, of FePS₃ NSs under 1064 nm laser irradiation

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2.4 材料的细胞毒性及光学治疗效果

本研究利用CCK-8分析评估了FePS₃-PEG的体外细胞毒性。如图8所示, 4T1细胞与不同浓度FePS₃-PEG纳米片在黑暗中分别共孵育12和24 h后, 细胞活力并未受到明显抑制, 且与120 μg/mL 的FePS₃-PEG共孵育24 h后还能保持94.7%的细胞活力, 表明材料在检测浓度范围内具有良好的细胞相容性。

图 8. 4T1细胞与不同浓度FePS₃-PEG共孵育后的相对活力

Fig. 8. Relative cell viabilities of 4T1 cells after incubation with different concentrations of FePS₃-PEG

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为了研究FePS₃-PEG纳米片的光学治疗作用, 本研究将4T1细胞与安全范围内的不同浓度FePS₃-PEG共孵育4 h后分别用660 nm (0.5 W/cm², 10 min)和1064 nm (1 W/cm², 10 min)激光辐照进行光动力学治疗和光热治疗(图9), 当4T1细胞经光动力学治疗或者光热治疗后, 细胞活力明显降低。当材料浓度为100 μg/mL时, 单独经660 nm激光辐照后(光动力学治疗)的细胞活力仅为25% (图9(a)); 类似地, 单独经1064 nm激光照射后(光热治疗), 细胞活力仅为13% (图9(b)), 即细胞致死率高达87%。光动力学治疗和光热治疗均表现出随FePS₃-PEG浓度增加而增强的4T1细胞生长抑制效果。

图 9. 与不同浓度FePS₃-PEG 共孵育后对4T1细胞进行的体外光动力学治疗(a)和光热治疗(b)

Fig. 9. In vitro photodynamic therapy (a) and photothermal therapy (b) treatment of 4T1 cells after incubation with different concentrations of FePS₃-PEG

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此外, CLSM观察结果也证实了激光辐照下FePS₃-PEG显著的光毒性(图10(a))。与对照组相比, 单纯的材料或激光辐照处理对细胞活力几乎没有影响, 而在材料用 660或1064 nm激光辐照组观察到部分死细胞(红色), 而联合治疗组则表现出最明显的4T1细胞杀伤效果。另外, 使用DCFH-DA探针可以检测光动力学效应中ROS的产生。如图10(b)所示, 只有同时满足存在FePS₃-PEG且被660 nm激发这两个条件的单纯光动力学治疗组和联合治疗组才能观察到指示ROS的绿色荧光, 表明FePS₃-PEG可在激光辐照下产生电子-空穴空间分离, 并与周围水或O₂分子进一步相互作用生成ROS。过量的ROS会导致线粒体膜通透性增加和线粒体膜电位丧失, 释放凋亡因子并最终诱导细胞凋亡^[35,36]。JC-1作为一种亲脂性阳离子染料, 可以选择性地进入线粒体, 在进入正常生理功能的线粒体后, JC-1转化为红色的聚集体, 而在功能异常的线粒体中则表现为绿色的单体。如图10(c)所示, 与材料共孵育且经660 nm激光辐照组观察到显著的线粒体损伤, 说明FePS₃-PEG可作为光敏剂生成大量ROS, 使线粒体功能失调并最终诱导癌细胞凋亡。另外由于线粒体对热敏感, 单纯光热治疗组中近红外光辐照引起的细胞内温度升高也会导致线粒体膜的通透性增加^[37], JC-1探针被迅速摄入线粒体内以单体形式存在并发出绿色荧光。说明光热治疗过程中激光辐照产生的局部高温也能导致肿瘤细胞凋亡。

图 10. 经不同处理后的4T1细胞活力(a)、ROS产物(b)及线粒体膜电位变化(c)的CLSM荧光照片

Fig. 10. Confocal laser scanning microscope (CLSM) images of 4T1 cell viabilities (a), reactive oxygen species (ROS) production (b) and changes in mitochondrial membrane potential (c) after different treatments Calcein-AM/PI, DCFH-DA and JC-1 represent methods for detecting cell viability, ROS production, and changes in mitochondrial membrane potential, respectively

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3 结论

本研究采用高温固相合成法煅烧元素粉末得到FePS₃块状晶体, 对块状晶体材料进行超声液相剥离, 离心收集得到具有二维片状结构且平均水合粒径约为153 nm的FePS₃纳米片。LA-PEG修饰FePS₃纳米片可提高其细胞相容性和稳定性。FePS₃在可见光区域的光激发特性和在近红外二区生物耐受剂量范围内显著的辐射吸收性能, 赋予其肿瘤光学治疗功能。FePS₃纳米片在660 nm激光辐照下能将基态氧转化为¹O₂而诱导细胞凋亡, 获得光动力学治疗效果; 在1064 nm激光辐照下可将光能转换为热能并实现19.7%的光热转化效率, 获得光热治疗效果。最为重要的是, FePS₃纳米片可以实现光热和光动力学联合治疗肿瘤效果。因此, 本研究制备的FePS₃纳米片在肿瘤治疗领域具有较大的应用潜力。