胰蛋白酶生产障碍会阻碍消化过程, 在胰腺组织以外产生胰蛋白酶可能涉及癌症过程。 胰蛋白酶明显增高可能表明胰腺炎或者慢性肾功能衰竭等病症的发生, 它的含量与生命活动息息相关, 简单并及时监测胰蛋白酶含量对疾病的诊断具有重要的参考价值。 因此, 该研究构建氮化碳量子点和金纳米簇（CNQDs和AuNCs）的复合纳米探针检测尿液中胰蛋白酶含量。 通过煅烧三聚氰胺获得氮化碳粉末, 并将氮化碳粉末作为原材料通过溶剂热法合成了发射峰在440 nm的类石墨相氮化碳量子点（CNQDs）。 牛血清蛋白（BSA）和CNQDs两者同时作为还原剂和稳定剂合成了金纳米簇（AuNCs）, 且AuNCs吸附在氮化碳量子点表面形成具有双发射性质的CNQD-AuNCs复合荧光纳米材料, 发射波长分别为440 nm（CNQD的发射波长）和650 nm（AuNC的发射波长）。 由于胰蛋白酶能特异性的水解CNQD-AuNCs中的牛血清蛋白, 导致牛血清蛋白结构被破坏, 从而破坏AuNCs稳定的结构, 使得其沉淀聚集, 引起荧光猝灭。 由于AuNCs产生的650 nm处的荧光被猝灭, 而CNQDs产生的440 nm处的荧光不受影响, CNQD-AuNCs复合荧光纳米探针产生比率型荧光信号响应。 利用比率型荧光信号的变化情况, 可实现胰蛋白酶的定量检测。 CNQD-AuNCs探针在650 nm处的荧光强度随着胰蛋白酶浓度的增加而逐渐下降, 而440 nm处的荧光强度保持不变。 胰蛋白酶在一定浓度下（10～400 ng·mL-1）与荧光强度比值（I650/I440）呈良好的线性关系, 建立的线性方程为y=2471-0004x［y为荧光强度比值（I650/I440）, x为胰蛋白酶的浓度（ng·mL-1）］, 相关系数（R2）高达0997 6, 检测限为15 ng·mL-1（3倍信噪比）。 利用建立的荧光法检测尿液中胰蛋白酶（实际含量分别为50, 100和150 ng·mL-1）, 检测得到的平均含量分别为5241, 10325和15439 ng·mL-1。 尿液中胰蛋白酶的回收率和相对标准偏差范围分别为10293%～10482%和357%～416%。 结果表明, 利用荧光强度比值（I650/I440）作为胰蛋白酶定量检测的信号, 能够校正外界影响因素的干扰, 克服单一荧光信号易受光漂白、 探针浓度、 激发光强度以及光程等外界因素的影响的缺点。 基于CNQD-AuNCs建立的比率型荧光分析方法能够实现尿液中胰蛋白酶的高灵敏度和高特异性检测, 为实际样品中胰蛋白酶的检测提供科学依据。

本文主要通过荧光光谱法与分子对接技术研究了在298, 303, 310 K温度下头孢他啶(CFD)与胰蛋白酶(TRP)之间的作用机制。研究结果表明, CFD与TRP之间是通过1∶1的静态猝灭方式相互作用。依照双对数方程处理荧光猝灭数据得到了CFD与TRP作用的结合常数Ka和结合位点数n。通过热力学方程求得了不同温度下CFD与TRP作用的热力学参数。实验数据表明, 它们之间的作用力主要是疏水作用和氢键作用, 这与分子对接技术所得的结果是一致的。

托拉塞米(TOR)属于吡啶磺酰脲类袢利尿剂, 被广泛有效地用于高血压, 心脏衰竭, 慢性肾功能衰竭和肝脏疾病的治疗。 TOR在治疗过程中易引起的不良反应之一为轻微肠胃不适。 然而, TOR与消化蛋白酶(胰蛋白酶和胃蛋白酶)分子间的相互作用鲜有报道。 在模拟生理条件下, 采用荧光光谱、 紫外-可见吸收光谱、 圆二色谱和分子对接技术研究了不同温度下托拉塞米(Torasemide, TOR)与胃蛋白酶(Pepsin)和胰蛋白酶(Trypsin)间的相互作用。 所有荧光数据均进行了内滤光校正以获得更准确的结合参数。 结果表明, TOR-Pepsin和TOR-Trypsin体系的猝灭常数(KSV)均与温度呈负相关, 说明TOR与Pepsin及Trypsin之间的作用机制均为静态荧光猝灭。 利用紫外-可见吸收光谱、 同步荧光光谱、 3D荧光光谱和圆二色光谱法考查了TOR对Trypsin和Pepsin构象的影响。 结果发现胃蛋白酶或胰蛋白酶中酪氨酸残基的极性改变较色氨基更明显, TOR可改变色氨酸残基的微环境并降低Trypsin和Pepsin中β-折叠结构, 进而可能影响其生理功能。 分子对接结果表明, TOR与Pepsin的结合位点位于由Asp-32和Asp-215组成的活性中心周围, 从而抑制Pepsin活性。 而TOR通过疏水作用力结合在Trypsin的口袋型底物结合位点(S1口袋), 促进底物进入酶活性中心, 最终表现为Trypsin活性升高。 该研究探讨了TOR与胃蛋白酶和胰蛋白酶的结合作用和毒性机制, 为TOR的安全使用提供重要依据。

采用超高压技术处理胰蛋白酶,改变其空间结构,研究酶空间结构变化与酶活力之间的关系.采用傅立叶红外光谱(FTIR)检测超高压处理后胰蛋白酶的二级结构变化;采用荧光光谱检测处理后胰蛋白酶的三级结构;酶活力的检测采用福林酚法.结果显示,与未处理的相比,在37 ℃,不同压力(100～600 MPa)条件处理20 min,对胰蛋白酶活力影响显著(p＜0.05).其中,300 MPa处理,胰蛋白酶活力达到最大,较未处理的酶活提高了0.386倍.FTIR检测分析显示,300 MPa处理的胰蛋白酶,α-螺旋与β-转角的峰面积比值达到最大(2.749);内源性荧光光谱检测结果显示,当激发波长为295 nm,其荧光强度达到最高值(1 353);激发波长为280 nm,其荧光强度达到最高(4 262);外源性荧光光谱结果显示,当激发波长为228 nm,疏水氨基酸残基的荧光强度达到最高(2 022);上述荧光强度的变化较0.1 MPa处理的胰蛋白酶均有显著差异(p＜0.05).结论:超高压处理影响胰蛋白酶的空间结构及酶活性.其中,胰蛋白酶活性与α-螺旋和β-转角的峰面积的比值、色氨酸等疏水氨基酸及酪氨酸残基暴露程度有关。

在真空及低压高频脉冲(LHPEF) 条件下, 结合胰蛋白酶降解猪Hb, 利用高效凝胶色谱、Native-PAGE蛋白电泳及紫外扫描来测定其降解效果。结果表明在37 ℃温度下, 1.88 V、200 kHz的LHPEF处理猪Hb, 电导率为3.45326×105 μs/cm(对照组为0.645×104 μs/cm) 。紫外扫描曲线图中的真空LHPEF胰蛋白酶降物中有8个特征吸收峰, 而对照组中为6个吸收峰, Native- PAGE蛋白质电泳图中有13个明显色带, 而对照组中只有6个色带, 高效凝胶色谱图中的特征吸收峰为48个, 对照组中7个特征吸收峰。