蛋白质和糖是食品的重要组分。 在食品加工、 贮运过程中, 蛋白质分子中的氨基与还原糖的羰基很容易以共价键的形式相结合发生糖基化反应。 美拉德式糖基化反应包括早期、 中期和末期三个阶段。 糖基化反应使得蛋白质分子主链或侧链发生修饰, 改变蛋白质结构、 静电荷和疏水性等, 影响蛋白质主链和侧链基团的化学活性, 进而改变蛋白质的理化功能性质, 如改善乳化性、 起泡性、 凝胶性等功能性质, 提高抗氧化性等营养特性, 降低致敏性, 增强抑菌性和贮藏特性等, 在食品加工、 贮运过程中非常普遍且有着重要意义。 糖基化反应过程中引起的蛋白质结构变化是其营养、 功能特性改变的重要原因。 近年来, 化学测定(自由氨基含量、 表面疏水性测定等)、 光谱(紫外、 荧光、 傅里叶变换红外光谱等)、 色谱(圆二、 分子排阻色谱等)、 质谱［基质辅助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、 液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS2)等］等多种技术手段被探索用于分析蛋白质糖基化反应过程中的结构变化规律, 在糖基化反应机制研究及糖基化反应程度、 产物营养功能性质调控等方面起了重要作用。 尤其是轨道离子阱质谱(LC-Orbitrap-MS2)、 傅里叶变换离子回旋共振质谱(LC-FTICR-MS2)、 氢氘交换-傅里叶变换离子回旋共振质谱(HDX-FTICR-MS2)等技术的出现和成熟应用让糖基化位点研究更加深入, 可以对各位点的糖分子连接数和糖基化取代程度进行定量分析, 使得揭示蛋白质糖基化反应机制变为可能。 对基于蛋白质糖基化反应程度、 一级、 二级、 三级结构和官能团结构的表征和检测方法进行综述, 旨在为蛋白质糖基化反应的深入研究和在食品加工中的应用提供参考。

糖基化反应能诱导食品中蛋白质的结构发生改变； Ara h2是花生中的主要蛋白组分之一, 可以作为一种模式蛋白研究花生蛋白糖基化产物的结构变化。 不同还原糖对Ara h2糖基化反应的影响目前未见相关报道。 以花生蛋白Ara h2为研究对象, 通过SDS-PAGE、 内源荧光、 同步荧光、 紫外、 圆二色谱、 红外等光谱技术研究Ara h2糖基化前后分子量、 二级、 三级结构以及官能团的变化, 分析六种还原糖(核糖、 木糖、 半乳糖、 葡萄糖、 果糖、 乳糖)对花生蛋白Ara h2糖基化产物结构的影响, 阐明经不同还原糖修饰后花生蛋白Ara h2的结构变化。 SDS-PAGE电泳表明木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2电泳条带明显上移, 糖基化程度最大； 紫外光谱分析表明糖基化反应会改变花生蛋白Ara h2的吸收峰强度。 五碳糖修饰的花生蛋白Ara h2具有最强的吸收强度, 其中五碳糖中木糖的吸收峰强度最大； 内源荧光、 同步荧光和三维光谱实验结果表明, 糖基化修饰会使花生蛋白Ara h2的荧光强度降低, 且五碳糖修饰的Ara h2荧光强度最低。 分析认为由于糖基化修饰使花生蛋白Ara h2的结构展开, 导致芳香族氨基酸暴露在水环境中, 从而引起荧光猝灭； 圆二色谱分析表明不同还原糖修饰的Ara h2糖基化产物α-螺旋含量都增加, 其中木糖修饰的α-螺旋含量最大(15.6%)； 红外光谱分析表明木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2的吸收峰分别从3 327.41 cm-1红移至3 318.43和3 321.09 cm-1, 1 700～1 600 cm-1处木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2吸收峰强度略高于其他还原糖修饰的该蛋白。 不同还原糖对Ara h2糖基化反应后的糖基化产物结构的影响不同, 还原糖的碳链越短、 空间位阻越小, 糖基化反应程度越高, 对Ara h2的结构影响越大。

基于传统热处理方式的蛋白质糖基化反应存在反应时间长、 易产生有害糖基化反应末期产物等缺点。 以卵类粘蛋白（OVM）-还原糖（1∶0.03, W/W）体系为对象, 研究新型高温热处理技术-过热蒸汽对OVM糖基化反应及蛋白质结构的影响。 结果表明: 短时间（1～3 min）的过热蒸汽（110和120 ℃）处理即可促使OVM发生糖基化反应, 其中不同糖的糖基化反应活性顺序为核糖（五碳糖）＞葡萄糖（六碳糖）＞乳糖（二糖）, 糖基化反应后蛋白质的自由氨基含量由19.97 mg·mL-1分别最低降为2.93, 5.04和6.69 mg·mL-1。 不同条件处理下OVM糖基化产物的紫外光谱未见显著的波峰位移, 但最大吸收峰峰值发生一定的变化, 其中大部分为降低的, 说明OVM的球蛋白分子结构发生变化, 还原糖的修饰掩盖了OVM上的发色基团（苯丙氨酸和酪氨酸）, 其中核糖糖基化反应下效果最为显著。 糖基化反应后, 荧光光谱峰强度显著降低, 其中核糖糖基化反应降低率最大, 其次为葡萄糖和乳糖, 表明蛋白质内部暴露的荧光基团去折叠导致荧光猝灭。 此外, 还原糖作为猝灭剂渗透入蛋白质框架中, 与荧光基团反应, 抑制其荧光发射。 红外光谱分析发现经过热蒸汽处理后OVM糖基化产物3 300 cm-1处的峰变窄, 表明N-H的含量减少或者发生反应, 从而使N-H伸缩振动频率降低。 2 000～2 500和500 cm-1附近出现了较多杂峰, 表明蛋白质发生降解或者有糖基化反应中间产物生成。 MALDI TOF MS分析表明热蒸汽处理下, OVM-核糖体系、 OVM-葡萄糖体系各有约6个糖基化反应位点, OVM-乳糖体系有约2个糖基化反应位点。 糖基化反应后有OVM二聚体、 三聚体和多聚体形成, 其中核糖和葡萄糖与OVM反应产生的聚合物最为显著, 乳糖与OVM反应产生的聚合物较少。 该研究可为短时微糖糖基化反应及过热蒸汽在食品加工中的应用提供一定的技术和理论指导。

实验室前期研究结果表明, 在国家规定的药食两用物品名单中, 丁香抗氧化活性最强。 前人发现天然产物的抗氧化功能与抗糖基化活性息息相关。 因此, 目的是在此基础上进一步对丁香精油(clove essential oil, CEO)的抗糖基化活性及其中含量最高的组分-丁香酚(Eugenol)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的相互作用进行研究。 在低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)的非酶糖基化孵育体系中, 光谱测定结果表明CEO对LDL糖基化早期、 中期和末期产物的生成均具有显著的抑制效果, 且对末期产物的抑制作用最强。 采用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)对CEO分析发现, CEO中含量最多的组分是丁香酚。 通过多光谱和分子对接对丁香酚与BSA的相互作用研究发现, 紫外-可见(ultraviolet-visible, UV-Vis)光谱表明丁香酚与BSA之间存在相互作用; 在荧光发射光谱中, 随着丁香酚浓度增加, BSA的荧光强度逐渐增强且发生蓝移, 进一步证明了二者之间存在相互作用。 通过计算不同温度下的结合常数发现, 丁香酚与BSA产生相互作用过程中有热力学过程参与, 热力学参数和位点标记竞争试验表明丁香酚通过氢键和范德华力与BSA在位点Ⅰ结合。 随着丁香酚浓度增加, 丁香酚与BSA混合体系的同步荧光(synchronous fluorescence, SF)、 三维荧光(three-dimensional, 3D)和傅里叶变换红外(Fourier transform infrared, FTIR)光谱的信号强度在发生变化的同时也发生了位移, 表明丁香酚的添加使BSA构象发生了改变。 通过分子对接技术进一步验证了丁香酚与BSA间相互作用的试验结果。 该研究为丁香进一步开发应用提供理论支持。

晚期糖基化终末产物（AGEs）是一种结构多样的化合物, 在人体血糖高于正常范围时, 会大量产生且不能通过自身代谢降解, 具有血糖长期异常的记忆作用。 研究表明AGEs是引起糖尿病及其并发症的重要因素之一, 通过检测体内AGEs的积累情况可以预测糖尿病及其并发症的发生和发展进程。 现有的离体AGEs检测方法存在操作复杂、 时间较长、 成本较高和不易推广等问题; 在体AGEs检测方法存在皮肤色素、 年龄和血红蛋白干扰等问题。 为此, 基于角膜良好的光学特性和AGEs的自体荧光特性, 提出一种角膜晚期糖基化终末产物荧光光谱检测方法。 构建了一套角膜AGEs荧光光谱检测系统, 系统由微型光纤光谱仪、 集成LED激发光源、 Y型12+1光纤和PC端光谱处理显示软件组成。 荧光光谱检测系统采用激发光源波长分别为370和395 nm在暗室条件下对17名志愿者（男性9人, 女性8人, 糖尿病患者4人, 年龄最小15周岁, 最大81周岁）进行数据采集, 得到激发光波长分别为370和395 nm的荧光光谱数据。 为了准确识别荧光光谱中的有用信息, 先截取需要的荧光光谱数据段（450~700 nm）, 然后对其进行去除背景噪声、 归一化、 小波变化等方法处理, 可以将荧光光谱中不明显的荧光峰值进行放大和识别。 实验结果发现, 采用波长为370和395 nm的LED作为激发光源, 检测到角膜发射的荧光光谱范围在420~600 nm内, 并且都分别在450~500, 500~550和550~600 nm三个范围内存在光谱峰值。 根据荧光性物质的荧光峰值与激发光波长无关的原理, 表明两种不同波长的激发光所得到的荧光光谱都是由同一种物质AGEs产生。 对糖尿病患者和正常人的荧光峰值强度进行分析, 显示糖尿病患者的荧光强度明显高于正常人, 表明本研究通过荧光光谱法检测角膜晚期糖基化终末产物具有可行性。

用干法制备糖基化产物。 人血清白蛋白(HSA)与葡萄糖质量比1∶1, 溶解混和均匀, 经48 h冷冻干燥, 根据不同反应时间得到20个样本。 旨在联合多光谱学技术(紫外、 荧光、 近红外、 红外和圆二色光谱(CD光谱))分析人血清白蛋白糖基化前后二级三级结构和官能团的变化信息, 以及分析不同反应时间对HSA糖基化产物结构特性的影响。 实验结果表明: HSA与葡萄糖在干热条件下极易发生糖基化反应; 随反应时间延长, 蛋白质紫外吸收强度减弱, 内源荧光吸收强度增强, 糖基化反应增强, 美拉德反应程度提高, 蛋白质二级三级结构相应发生变化。 反应到140 min左右时, 美拉德反应前期糖基化反应完全, 生成Amadori产物, 进一步加热反应到220 min左右, 反应进入中后期, 开始生成醛酮类物质, 反应到280 min左右, 蛋白质氨基酸与羰基化合物发生脱羧、 脱氨反应。

实验研究微波对蛋清蛋白粉与葡萄糖干样混合体系的影响, 构建微波条件下蛋清蛋白-葡萄糖圆柱体反应模型。 通过改变微波的功率, 时间和位置, 采用红外热像仪、 荧光、 紫外, 高效液相色谱等方法研究微波场中蛋清蛋白糖基化产物不均匀性。 将蛋清蛋白粉末与葡萄糖等质量混合, 手工震荡和研钵充分研磨后在平皿表面铺一薄层粉末, 放置于微波炉中心反应。 将反应后的样品按左、中、右分成三个规则区域均匀采样。 热像图表明微波功率越高, 样品表面温度越高。 凝胶电泳图表明240 W微波加热30 min样品边缘已经发生了反应, 而且样品中间部分几乎还未反应; 自由氨基含量测定表明高功率长时间微波作用才会观测到明显糖基化反应而低功率短时间条件下反应不明显, 且边缘部分的样品反应总是比中间部分的样品剧烈; 通过荧光光谱可知, 蛋清蛋白和葡萄糖发生了反应, 而样品边缘部分荧光强度降低得比样品中间部分多说明样品边缘反应更加剧烈; 紫外光谱测定表明越剧烈的微波条件样品紫外吸收越多, 边缘部分紫外吸收最高。 液相结果也证实了这一点, 糖基化样品边缘部分5-羟甲基糠醛(HMF)含量明显高于样品中间部分, 且随时间和功率逐渐增加。

糖尿病引起患者全身多部位发生慢性并发症, 严重危害患者的生命安全, 成为其致死致残的主要原因。 糖尿病患者体内的高血糖环境引发的组织内氧化应激反应增加是糖尿病并发症的重要发病机制之一, 而蛋白非酶糖基化反应和脂质过氧化反应过程与氧化应激密切相关。 从糖尿病并发症的发病机理出发, 以氧化应激为基点, 运用光谱法对17种中药提取物抗氧化应激反应的活性进行综合考察。 利用大鼠肝脏体外脂质自氧化反应结合紫外光谱法对中药提取物抑制脂质过氧化反应的能力进行评价, 中药黄芩和槐米具有较强的抑制活性, 富含黄酮类、 生物碱类及木脂素类提取物表现出较好的脂质过氧化反应抑制作用, 而皂苷类成分的活性相对较弱。 以牛血清白蛋白/葡萄糖(果糖)体系为糖基化筛选模型, 利用荧光光谱法对体外避光孵育反应体系进行研究, 中药槐米、 黄芩和知母表现出了较强的非酶糖基化反应抑制能力。 由17种中药提取物抗氧化应激反应的结果分析, 富含黄酮类成分中药的抗氧化应激作用强于生物碱类、 木脂素类和萜类的, 皂苷类中药的活性相对较弱; 而体外综合活性较好的中药槐米和黄芩可作为下一步研究的主要对象。 本研究为进一步的药理活性研究提供了一定的理论指导, 为开发防治糖尿病并发症的中药新药奠定基础。