谷子白发病是威胁谷子产量和品质的重要系统性侵染病害。在抵抗病原菌的过程中，抗病相关基因起着尤为重要的作用。几丁质酶(Chitinase，EC.3.2.1.14)是植物抗病反应过程中的一类重要的病程相关蛋白，在植物防御病原菌侵染和害虫危害中扮演重要的角色。本研究在前期对白发病菌侵染抗感谷子品种转录组分析的基础上发现几丁质酶家族基因在抗感品种中显著差异表达，推测该家族基因可能参与谷子对白发病的抗病反应过程。基于此，本研究运用生物信息学相关技术对筛选出的30个谷子候选抗病相关几丁质酶家族基因进行染色体定位，利用TBtools等软件对该基因家族的理化性质、基因结构、发育树构建、蛋白序列及其转录水平进行分析。结果表明，30 个谷子几丁质酶家族基因分布在8条染色体上(第6条染色体除外)。几丁质酶蛋白均含有分泌信号肽，预测为分泌蛋白，且具有保守蛋白基序。系统发育树分析显示，该基因家族成员可分为3个亚组。结合白发病菌侵染抗感谷子转录组数据，根据其表达模式的差异，可分为上调、下调和不表达3 类基因。荧光定量 PCR 结果表明，Seita.1G225300、Seita.4G286000、Seita.5G389900、Seita.7G150600、Seita.7G150700和Seita.8G076900这些基因表达在抗感品种中存在显著差异，很可能参与抗白发病的调控过程。其研究结果有望为谷子抗病基因克隆及分子育种提供一定的理论参考。

几丁质是真菌细胞壁中一种重要的结构多糖, 本文首次采用共聚焦显微拉曼技术对山茶刺盘孢菌的气生菌丝进行原位检测研究, 首先确定了采集菌丝拉曼光谱的最优实验参数, 并获得了菌丝, 几丁质标准品和背景三种物质的典型拉曼光谱, 对其中的特征峰进行归属分析, 发现菌丝光谱中有明显的几丁质特征峰。 然后对置于载玻片上菌丝的感兴趣区域进行拉曼光谱面扫描, 通过主成分分析法发现面扫描区域中, 菌丝和背景两种信号可以明显区分开来, 结合主成分的载荷因子图得到了菌丝的两个主要的特征差异峰1 622和1 368 cm-1, 1 622 cm-1属于菌丝中几丁质的特征峰, 而1 368 cm-1是来源于菌丝中的果胶多糖。 最后通过对几丁质在1 622 cm-1特征峰波段附近范围积分, 绘制了几丁质在菌丝中二维和三维的化学成像图, 直观且无损的再现了几丁质在菌丝中的空间分布。

几丁质、 麦角甾醇和真菌毒素可以反应真菌侵染程度和危害性。 对几丁质、 麦角甾醇和真菌毒素进行监测， 可有效控制霉变的发生。 传统检测方法耗时、 繁琐， 而且不能及时有效地反映检测结果。 近红外光谱技术以其简便、 快捷等优越性广泛应用于不同领域， 在品质检测中有巨大的应用潜力和前景。 文章在介绍近红外技术（NIRS）的发展状况、 特点及其在品质分析上的应用的基础上， 着重阐述了近红外技术（NIRS）在真菌生物量（几丁质、 麦角甾醇）和真菌毒素检测中的研究和进展， 并对其应用前景进行了展望。 随着不同模型的定标方程的建立和模型数据库的不断完善， NIRS将会在真菌研究领域发挥越来越大的作用。

采用改进的方法提取粘质沙雷氏菌基因组DNA,通过PCR扩增,得到大小为1500 bp特异性DNA片段(chiB基因),以pUC18质粒构建了pUC-chiB克隆载体,转化至感受态细胞E.coli DH5a培养,并筛选出重组质粒.经测序分析,证明克隆片段与文献报道相一致.

根据本研究组已克隆的大白菜Class Ⅳ类几丁质酶基因序列设计引物,通过RT-PCR反应扩增得到该几丁质酶成熟肽基因CHB4,构建原核表达载体pET-CHB4,利用IPTG诱导表达并对诱导表达参数进行优化,SDS-PAGE分析表明,该基因表达的蛋白分子量为28 kD左右,其表达产物主要以包涵体的形式存在,25 ℃并没有改变表达蛋白的可溶性,而在pH 9.5的培养基条件下,诱导表达产物的上清液中却有重组蛋白条带出现.以酵母菌为指示菌做抑菌圈实验,结果显示IPTG浓度为0.6 mmol/L时抑菌效果最明显.几丁质酶的活力测定结果表明,当IPTG浓度为0.6 mmol/L时,几丁质酶活力达到最大值2.8 U/mL.

本实验从虫生真菌中筛选出金龟子绿僵菌Ma83菌株,它的几丁质酶合成能力最强.其产酶的适宜条件是,碳源为胶体几丁质加葡萄糖,氮源为NaNO3,培养温度为28℃,培养基起始pH 6.O;接种量为5 mL液态种,最适装液量为5 mL,添加维生素C可以提高酶活;正交实验表明培养因子的最佳组合是:NaN03 1 g/L,胶体几丁质O.6 g/L,酵母膏0.05 g/L,葡萄糖0.10 g/L.根据液态培养产酶过程结果可知,当Ma83菌培养6天时,几丁质酶活力达到8.1 U/mL.

从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)entomocidus亚种HD109菌株中克隆了几丁质酶基因chiA74-HD109,其序列全长为2 031 bp,编码676个氨基酸,GenBank登录号为AY455290.其编码产物与蜡状芽孢杆菌几丁质酶CHiB(AB041932)的相似性达97.9%,与Bt kenyae亚种LBIT-82菌株几丁质酶chiA74(AF424979)的相似性达98.4%,与Bt pakistani亚种几丁质酶(U89796)的相似性为83.0%,与Bt kurstaki亚种几丁质酶kchi(AY189740)的相似性达97.8%,与Bt israelensis亚种几丁质酶(AF526379)的相似性达96.6%,与Bt几丁质酶(AY074882)的相似性达98.4%,与Bt sotto亚种几丁质酶(AY129671)的相似性为97.3%.功能结构域分析显示其编码区包含信号肽、催化区、Ⅲ型粘蛋白同源区及几丁质结合区4个部分.

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pBIBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因.激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株.研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等.研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难.

通过激光微束穿刺法，将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因双价植物表达载体pBLGC导入棉花幼胚。转化一代棉花幼苗用蘸根法进行抗黄萎病筛选，将存活的苗移入病圃进行了卡那霉素(Kan 1%)抗性测定。结果表明，在移栽的29株幼苗中，有9株表现出明显的Kan抗性，对9株抗Kan植株进行了PCR检测，结果显示，其中7株表现为阳性。病圃中的T1代转基因植株在经历了黄萎病发病高峰期后，7株PCR阳性植株表现明显抗病，并已正常开花结铃，其他T1代植株及对照植株全部因后期发病死亡。这初步证明外源基因已整合到棉花基因组中，且使转基因植株对黄萎病表现出一定的抗性。