Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and single particle tracking (SPT) techniques determine the diffusion coefficient from average diffusive motion of high-concentration molecules and from trajectories of low-concentration single molecules, respectively. Lateral diffusion coefficients measured by FRAP and SPT techniques for the same biomolecule on cell membrane have exhibited inconsistent values across laboratories and platforms with larger diffusion coefficient determined by FRAP, but the sources of the inconsistency have not been investigated thoroughly. Here, we designed an image-based FRAP-SPT system and made a direct comparison between FRAP and SPT for diffusion coefficient of submicron particles with known theoretical values derived from Stokes–Einstein equation in aqueous solution. The combined iFRAP-SPT technique allowed us to measure the diffusion coefficient of the same fluorescent particle by utilizing both techniques in a single platform and to scrutinize inherent errors and artifacts of FRAP. Our results reveal that diffusion coefficient overestimated by FRAP is caused by inaccurate estimation of the bleaching spot size and can be corrected by simple image analysis. Our iFRAP-SPT technique can be potentially used for not only cellular membrane dynamics but also for quantitative analysis of the spatiotemporal distribution of the solutes in small scale analytical devices.

超分辨显微技术突破衍射极限的分辨能力为研究纳米尺度的超精细结构和生理学过程提供了有力的观察手段,对研究细胞的功能以及疾病的发病机制有十分重要的影响,具有十分重要的生物医学意义。单分子定位成像技术作为超分辨成像技术的一个分支,具有重大的科研价值。从单分子定位成像技术的研究背景和意义出发,详细介绍了该技术的发展历程,对现有的主要单分子定位技术进行了较为详细的原理介绍和各自优缺点的分析,最后对单分子定位技术的实际应用进行了展望。

双光子成像(Two-Photon Imaging)技术以其优越特性被广泛用于活细胞动态三维成像, 但光功率极高的短脉冲光对焦平面荧光分子严重的光漂白极大地影响了双光子长时间成像的图像质量, 针对双光子荧光漂白问题, 本文提出一种优化光照的双光子(Optimized Lighting-Two Photon,OL-TP)成像技术。通过预扫描获取双光子图像分析高低阈值, 以预设的高低阈值为标准优化一幅图像中不同区域的光照时长, 利用扫描过程中记录的荧光信息和光照时间信息可以重建OL-TP图像, 既保证信噪比又降低荧光漂白。重建的OL-TP图像与传统双光子图像基本一致, 信噪比略有降低, 但图像并未失真。对110 nm的荧光小球样本分别连续取30幅普通双光子和优化光照的双光子图像, 到第30幅图时, 重建后的优化光照双光子图像比普通双光子图像荧光漂白降低了2886%。OL-TP通过优化光照时间大幅降低双光子成像的荧光漂白, 使双光子荧光显微镜能够更好地对生物样本进行长时间观测。

激发光引起的荧光漂白限制了共聚焦成像技术在长时间观测生物样本方面的应用。提出了一种基于可控光剂量的共聚焦成像技术(CLE-CM)，该技术通过预实验设置高低阈值，定时读取采样像素值并与预设阈值进行比较，根据比较结果控制每个物方像素的光照时间，以更高效地利用荧光信息，在不牺牲图像质量的情况下降低了荧光漂白。用CLE-CM和标准共聚焦对牛肺动脉内皮细胞样本连续成11幅图像，与第11幅标准共聚焦图像相比，第11幅CLE-CM图像的荧光漂白减少了52.62%，具体降漂白效果与样本中的荧光分布有关。CLE-CM通过减少光剂量大幅降低了共聚焦显微成像的荧光漂白，使共聚焦显微镜能连续成更多张高质量图像。

激光共聚焦同步双扫描(simultaneous, SIM)技术在常规扫描单元的基础上, 引入一个同步扫描单元(SIM scanner), 该技术独立控制了两个激光束, 一个用于激光光刺激, 另一个用于同步成像。本实验中, 采用激光共聚焦同步双扫描系统的405 nm和488 nm激光分别对细胞的特定部位进行刺激和同步成像, 实时检测了LC3复合物的形成, 记录并分析了乙酰化前后LC3的光动力学变化过程, 证实了LC3的脱乙酰化修饰是自噬性降解所必须的, 本实验体系为激光共聚焦双扫描技术的推广提供了一个很好的平台。SIM技术的应用, 解决了刺激过程无法成像的问题, 为漂白后荧光恢复(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)、漂白后荧光损失(fluorescence loss in photobleaching, FLIP)和光诱导激活等研究提供了最佳的解决方案, 可作为光刺激的一种实验模式在很多实验设计中进行延伸应用。

薄油膜润滑广泛存在于各类精密机械与微机电系统中。微纳米间隙内的润滑油流动是影响薄膜润滑承载力的重要因素, 但目前薄润滑油膜的流速测量仍然缺少有效手段。本文基于荧光漂白恢复显微技术和漂白区域形状演化过程的成像分析, 建立了油膜流速测量系统, 可以对微米间隙润滑油膜的速度分布进行原位测量。利用建立的系统获得了厚度为8 μm时聚丁烯PB450润滑油膜的库埃特流速分布。重建的荧光漂白强度分布曲线和实验测量结果的皮尔森相关系数大于0.95, 且流速分布符合已有润滑理论, 证明了测量结果的可靠性。

为研究动脉粥样硬化中单核细胞膜流动性的变化, 本实验选用20只新西兰白兔建立动物粥样硬化模型, 提取模型组与对照组兔外周血中单核细胞, 通过荧光漂白恢复技术检测单核细胞膜流动性, 并结合动脉粥样硬化动物模型病理切片揭示其与动脉粥样硬化相关性。结果显示动物动脉粥样硬化模型建立成功, 模型组单核细胞膜的荧光恢复率和扩散系数均低于对照组。本研究揭示了单核细胞细胞膜的流动性与动脉粥样硬化的发生有关, 为今后深入探究单核细胞与动脉粥样硬化关系提供实验基础。