WBP11是 WW结构域结合蛋白家族的一员, 参与前体 mRNA剪接过程, 是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一, 其基因组中含有人类 WBP11的同源基因 wbp11。为了研究 WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制, 利用 CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼 wbp11基因敲除品系。首先, 在 wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点, 体外转录合成 sgRNA, 通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除, 得到 F0代嵌合体斑马鱼。随后, 将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交, 所得到的 F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选出其中的杂合子斑马鱼, 并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序, 结果显示其为 wbp11基因的 2种缺失突变。让同种突变的 F1代杂合子斑马鱼自交, 对得到的后代 F2进行基因型鉴定, 筛选获得了纯合子斑马鱼, 表明 wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现, 受精后 48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形, 这可能是由于 wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究 WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链cDNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9 系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。

CRISPR/Cas9基因打靶技术是近几年发展起来的一种高效率的定向打靶技术, 被认为是遗传领域的革命性技术。Titin-Cap基因是本实验室已初步鉴定的斑马鱼心脏发育候选基因, 且国内外目前尚无斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。为了研究Titin-Cap基因在心脏发育过程中的作用机制, 我们利用CRISPR/Cas9基因打靶技术建立斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。测序结果显示, 注射了CRISPR/Cas9 gRNA的胚胎出现双峰, 说明在打靶位点附近出现了碱基缺失或插入, 证明我们设计的gRNA是有效的。对F0代突变体成鱼的筛选中, 测序结果同样显示有阳性结果。这些结果说明用CRISPR/Cas9基因打靶技术成功敲除了斑马鱼Titin-Cap基因, 获得了Titin-Cap基因敲除的嵌合体斑马鱼。

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型, 本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域, 也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点, 扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA, 并转录为RNA, 与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后, 在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA, 用特异性引物进行PCR扩增; 将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到pMD18-T载体, 再经质粒提取, 测序分析, 通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9 系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的, 该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。

目的:构建含有小鼠Lrrc10 (Leucine-rich Repeat Containing protein 10)基因的重组腺病毒表达载体。方法:设计小鼠Lrrc10特异性引物, 以小鼠cDNA为模板, 通过PCR扩增出mLrrc10的编码区, 并引入HA标签蛋白和Sal Ι酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18T载体。测序后, 用Sal Ι和Hind III酶切, 将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用Pme Ι线性化后, 用100 ng转化细菌 BJ5183, 在细菌内同源重组后得到 pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM 2000转染 293A细胞, 包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后, 反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞, 绿色荧光观察 GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果:用病毒液感染原代心肌细胞, 24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光, 提取心肌细胞总蛋白, Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论:小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功, 并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。

Mesp1属于bHLH转录因子家族, 对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能, 本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体, 转染进P19细胞, 经嘌呤霉素筛选并扩大培养后, 成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1基因的细胞系P19-Mesp1, 为研究Mesp1心脏发育相关功能提供有用的细胞研究模型。

ATF4是含有bZIP结构域的ATF/CREB转录因子家族成员, 对胚胎的发育以及细胞的增殖、分化有重要的调节作用。制备ATF4的多克隆抗体对于研究其在斑马鱼心脏发育过程中的作用有重要的意义。研究首先通过生物信息学方法, 选择ATF4基因中特异性强、具亲水性的一段核苷酸序列(1 017 bp), 通过PCR扩增, 将片段重组到原核表达载体pET-28a, 然后转化入Rosetta菌株中。经测序鉴定正确后, 用IPTG诱导表达融合蛋白, 以该融合蛋白免疫小鼠,获得ATF4多克隆抗鼠血清。对该多抗血清抗体进行验证, 具有很好特异性和较高效价, 可以用作Western-blotting、免疫印迹等试验分析。

运用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)构建pSUPER.retro-Smyd1真核表达质粒, 经鉴定后用脂质体法转染H9c2细胞, 通过G418筛选出稳定表达pSUPER.retro-Smyd1的细胞系, 最后经Western blot及RT-PCR实验鉴定其干扰效果。经鉴定, 通过H9c2细胞系构建的pSUPER.retro-Smyd1干扰细胞系的干扰效果显著。因此, 本实验成功构建了Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染的H9c2细胞系, 为进一步研究Smyd1基因在心脏发育中的作用奠定了良好的实验基础。

Foxp4为Fox基因家族的一员, 目前研究发现其与肺、肠、心脏以及中枢神经系统的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能, 有必要制备其多克隆抗体。按照巢式PCR原理, 经过两次PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Foxp4基因片段, 将其克隆入表达载体pGEX4T-1, 转化至大肠杆菌BL21中, 再通过IPTG进行诱导表达GST-Foxp4融合蛋白。融合蛋白先经谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化, 再经切胶纯化回收, 然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 分别进行Western-blot实验检测抗体效价和特异性。所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Foxp4多克隆抗体, 为Foxp4功能的进一步研究奠定了基础。

CXXC5基因是从人类胚胎心脏的cDNA文库中克隆出来的一个人类锌指基因, 包含zf-CXXC5结构域, 该基因编码322个氨基酸, 在物种进化上高度保守。为了进一步研究该基因的功能, 需要获得CXXC5蛋白并制备其抗体.通过PCR扩增方法扩增得到了CXXC5部分编码区序列, 然后将其连接到PGEX-4T-1 上, 转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中, 再通过自身诱导法诱导表达重组质粒的融合蛋白. 通过割胶回收纯化融合蛋白。免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, Western blot 检测抗体活性。结果表明, 实验获得了高质量的多克隆抗体。