adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员, 主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域, 与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用, 我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先, 通过分析软件筛选出该基因的敲除位点, 利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA), 再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收, 将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中, 得到F0代嵌合体。随后, 对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测, 结果表明, 注射的胚胎出现了碱基缺失的现象, 即sgRNA有效, 将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选adgrf3a突变杂合子, 并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序, 建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后, adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交, 获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现, adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异, 然而, 体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。

WBP11是 WW结构域结合蛋白家族的一员, 参与前体 mRNA剪接过程, 是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一, 其基因组中含有人类 WBP11的同源基因 wbp11。为了研究 WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制, 利用 CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼 wbp11基因敲除品系。首先, 在 wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点, 体外转录合成 sgRNA, 通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除, 得到 F0代嵌合体斑马鱼。随后, 将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交, 所得到的 F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选出其中的杂合子斑马鱼, 并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序, 结果显示其为 wbp11基因的 2种缺失突变。让同种突变的 F1代杂合子斑马鱼自交, 对得到的后代 F2进行基因型鉴定, 筛选获得了纯合子斑马鱼, 表明 wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现, 受精后 48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形, 这可能是由于 wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究 WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路

GPR112蛋白作为黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员，由GPR112基因编码。它含有7个跨膜结构域，与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼作为研究脊椎动物发育的重要模式生物，其基因组中含有GPR112的同源基因gpr112a，且在幼鱼和成鱼中均有表达。为了研究GPR112在脊椎动物生存和发育中的作用，利用CRISPR-Cas9技术构建了gpr112a基因敲除斑马鱼品系。首先，合成用于靶向gpr112a基因第二外显子的一对sgRNAs，经显微注射得到F0代嵌合体斑马鱼。然后，对嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选gpr112a突变杂合子，并对其gpr112a突变等位基因进行Sanger测序，以确定gpr112a基因敲除品系的建立。之后，gpr112a突变杂合子斑马鱼自交，获得gpr112a纯合子突变斑马鱼。经显微成像并观察发现，受精后7 dpf的gpr112a突变纯合子斑马鱼并没有出现与野生型差异明显的表型，这可能是斑马鱼机体的代偿机制所致。此研究为探究GPR112基因在脊椎动物生存和发育中的作用开辟了道路。

心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)是bHLH家族的成员, 也称为dHand、Hed和Thing2, 可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达。国内外的研究显示, Hand2主要影响右心室的发育, 在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用。为了进一步研究Hand2基因参与心脏发育的作用机制, 拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Hand2基因敲除品系。根据生物信息学网站的分析筛选出最优的两个靶位点, 设计并合成引物, 利用PCR扩增得到Hand2基因sgRNA的cDNA, 再转录为mRNA, 将两个靶位点sgRNA的mRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞期。在斑马鱼的胚胎和成鱼时期进行基因敲除的有效性检测, 发现在靶位点附近有碱基的缺失和插入, 表明CRISPR/Cas9对斑马鱼Hand2基因敲除是有效的。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型, 为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型, 本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域, 也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点, 扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA, 并转录为RNA, 与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后, 在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA, 用特异性引物进行PCR扩增; 将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到pMD18-T载体, 再经质粒提取, 测序分析, 通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9 系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的, 该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。

TALEN(transcription activator-like effector nuclease)打靶是一种定向敲除基因技术, 利用该技术能解决目前在斑马鱼体内难以进行基因敲除的难题。Klhl31是本实验室鉴定的人类心脏发育候选基因, 且目前国内外尚无斑马鱼Klhl31敲除品系。为了在斑马鱼的整体水平鉴定Klhl31的生物学功能, 我们利用TALEN打靶技术建立斑马鱼Klhl31基因敲除品系。酶切验证的结果显示, 注射了TALEN表达质粒的胚胎在酶切位点处发生了基因突变, 该突变破坏了酶切位点导致酶切出现阳性结果, 证明了TALEN打靶的有效性。对F0代突变体成鱼的筛选过程中, 经酶切验证, 同样出现了阳性结果。这些结果说明用TALEN这种技术成功敲除了斑马鱼Klhl31基因, 获得了Klhl31基因敲除的嵌合体斑马鱼。