1 湖南师范大学 动物肠道功能调控湖南省重点实验室，长沙 410081
2 湖南师范大学 动物营养与人体健康实验室，长沙 410081
3 湖南师范大学 体适能与运动康复湖南省重点实验室，长沙 410081
4 湖南师范大学 淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，长沙 410081
GPR112蛋白作为黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员，由GPR112基因编码。它含有7个跨膜结构域，与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼作为研究脊椎动物发育的重要模式生物，其基因组中含有GPR112的同源基因gpr112a，且在幼鱼和成鱼中均有表达。为了研究GPR112在脊椎动物生存和发育中的作用，利用CRISPR-Cas9技术构建了gpr112a基因敲除斑马鱼品系。首先，合成用于靶向gpr112a基因第二外显子的一对sgRNAs，经显微注射得到F0代嵌合体斑马鱼。然后，对嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选gpr112a突变杂合子，并对其gpr112a突变等位基因进行Sanger测序，以确定gpr112a基因敲除品系的建立。之后，gpr112a突变杂合子斑马鱼自交，获得gpr112a纯合子突变斑马鱼。经显微成像并观察发现，受精后7 dpf的gpr112a突变纯合子斑马鱼并没有出现与野生型差异明显的表型，这可能是斑马鱼机体的代偿机制所致。此研究为探究GPR112基因在脊椎动物生存和发育中的作用开辟了道路。
斑马鱼 基因敲除 代偿机制 zebrafish gpr112a gpr112a CRISPR-Cas9 CRISPR-Cas9 gene knockout compensatory mechanism
1 湖南师范大学动物肠道功能调控湖南省重点实验室, 长沙 410081
2 湖南师范大学动物营养与人体健康实验室, 长沙 410081
3 浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所, 杭州 310058
4 中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉科, 长沙 410011
5 湖南师范大学淡水鱼类发育生物学国家重点实验室, 长沙 410081
MYO7A是人类Usher综合征(US)的致病基因。由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%～55%。研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型(USH1B), 包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性(RP), 但其分子机制尚不清楚。为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制, 利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。首先, 通过分析软件筛选出该基因的敲除位点, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该基因的向导DNA(gDNA), 再以gDNA为模板转录得到向导RNA(gRNA), 将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中; 随后, 进行基因编辑的有效性检测。研究结果表明, CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。对其进行进一步筛选, 成功获得斑马鱼myo7ab基因敲除突变品系, 这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。
斑马鱼 myo7ab基因 内耳及视网膜发育 zebrafish CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 myo7ab gene inner ear and retina development
1 动物肠道功能调控湖南省重点实验室, 长沙 410081
2 湖南师范大学生命科学学院, 动物营养与人体健康实验室, 长沙 410081
3 淡水鱼类发育生物学国家重点实验室, 长沙 410081
4 中国科学院亚热带农业生态研究所, 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125
microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19~23个核苷酸的非编码RNA, 通过影响mRNA的稳定性和翻译, 来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用, 本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点, 两个敲除位点相隔132 bp, 利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA, 再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA, 将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测, 研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失, 表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选, 成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系, 为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。
斑马鱼 miR-196a-1基因 zebrafish microRNA microRNA CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 miR-196a-1 gene
1 湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究中心, 湖南 长沙 410006
2 南华大学药学与生命科学学院, 湖南 衡阳 421001
利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER -PYGO1)。首先, 针对 PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列, 经退火插入到由BglⅡ 和XhoⅠ酶切的pSUPER 质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果, 将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSUPER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析, 发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点, 且序列完全一致; RT-PCR和Western blot检测结果显示转染 pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此, 靶向PYGO1的 pSUPER RNAi 载体构建成功, 为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。
PYGO1基因 RNA干扰 PYGO1 RNA interference pSUPER pSUPER H9c2 H9c2
湖南师范大学生命科学院 蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室 心脏发育研究中心, 湖南 长沙 410081
斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、基因间相互关系和突变体筛选等方面, 是研究斑马鱼发育相关基因功能的重要技术。本文从杂交探针的制备、浓度的选择和洗脱以及胚胎的脱色、蛋白酶K消化、底物显色等方面进行了摸索、改进及简化, 获得了背景低、着色清晰、特异性高的实验结果, 预示了简单实用、成本低廉的斑马鱼整胚原位杂交技术平台的成功建立。
技术改良 整体原位杂交 斑马鱼胚胎 method improvement whole-mount in situ hybridization zebrafish embryos
