adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员, 主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域, 与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用, 我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先, 通过分析软件筛选出该基因的敲除位点, 利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA), 再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收, 将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中, 得到F0代嵌合体。随后, 对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测, 结果表明, 注射的胚胎出现了碱基缺失的现象, 即sgRNA有效, 将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选adgrf3a突变杂合子, 并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序, 建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后, adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交, 获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现, adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异, 然而, 体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。

WBP11是 WW结构域结合蛋白家族的一员, 参与前体 mRNA剪接过程, 是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一, 其基因组中含有人类 WBP11的同源基因 wbp11。为了研究 WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制, 利用 CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼 wbp11基因敲除品系。首先, 在 wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点, 体外转录合成 sgRNA, 通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除, 得到 F0代嵌合体斑马鱼。随后, 将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交, 所得到的 F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选出其中的杂合子斑马鱼, 并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序, 结果显示其为 wbp11基因的 2种缺失突变。让同种突变的 F1代杂合子斑马鱼自交, 对得到的后代 F2进行基因型鉴定, 筛选获得了纯合子斑马鱼, 表明 wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现, 受精后 48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形, 这可能是由于 wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究 WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路

GPR112蛋白作为黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员，由GPR112基因编码。它含有7个跨膜结构域，与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼作为研究脊椎动物发育的重要模式生物，其基因组中含有GPR112的同源基因gpr112a，且在幼鱼和成鱼中均有表达。为了研究GPR112在脊椎动物生存和发育中的作用，利用CRISPR-Cas9技术构建了gpr112a基因敲除斑马鱼品系。首先，合成用于靶向gpr112a基因第二外显子的一对sgRNAs，经显微注射得到F0代嵌合体斑马鱼。然后，对嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选gpr112a突变杂合子，并对其gpr112a突变等位基因进行Sanger测序，以确定gpr112a基因敲除品系的建立。之后，gpr112a突变杂合子斑马鱼自交，获得gpr112a纯合子突变斑马鱼。经显微成像并观察发现，受精后7 dpf的gpr112a突变纯合子斑马鱼并没有出现与野生型差异明显的表型，这可能是斑马鱼机体的代偿机制所致。此研究为探究GPR112基因在脊椎动物生存和发育中的作用开辟了道路。

心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)是bHLH家族的成员, 也称为dHand、Hed和Thing2, 可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达。国内外的研究显示, Hand2主要影响右心室的发育, 在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用。为了进一步研究Hand2基因参与心脏发育的作用机制, 拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Hand2基因敲除品系。根据生物信息学网站的分析筛选出最优的两个靶位点, 设计并合成引物, 利用PCR扩增得到Hand2基因sgRNA的cDNA, 再转录为mRNA, 将两个靶位点sgRNA的mRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞期。在斑马鱼的胚胎和成鱼时期进行基因敲除的有效性检测, 发现在靶位点附近有碱基的缺失和插入, 表明CRISPR/Cas9对斑马鱼Hand2基因敲除是有效的。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型, 为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。

斑马鱼广泛地应用于骨退化相关的机制研究和新药开发过程中。目前临床应用检测骨密度(BMD)的方法主要有单光子吸收、双光子吸收、双能X线吸收、定量CT和超声技术等, 上述方法均难用于斑马鱼的研究中。本文旨在寻求一种新式的、适用性强和操作简易的定量分析斑马鱼BMD的方法。对采集到的使用125 μmol/L泼尼松龙溶液诱导骨质疏松的斑马鱼在0、7、14、21 d的光学相干层析成像的图像依次进行灰度化、二值化、图像分割、阈值分割和密度投影, 最后进行了颅骨BMD统计。试验结果表明, 此方法可以有效地定量分析出不同天数斑马鱼骨质疏松程度, 适用于研究泼尼松龙诱导的不同天数对斑马鱼BMD的影响、大通量斑马鱼骨质疏松药物筛选、药物评价等, 是一种将斑马鱼颅骨BMD定量化分析的新方法。

视网膜母细胞瘤(RB)严重损害儿童视力健康与生命安全。本研究建立了一种光学相干层析成像(OCT)辅助的RB斑马鱼模型构建的新方法, 并利用OCT对RB细胞在眼内的分布与存活状态进行活体评估。试验随机选取了24条正常斑马鱼作为研究对象, 其中21条鱼用于构建RB斑马鱼模型, 具体做法是在OCT实时成像下, 通过针剂注射带荧光的RB细胞到其玻璃体内部, 剩余3条鱼作为对照。细胞注射后的0、24、48、72 h观察RB细胞的分布与存活状态, 同时, 建模前后都对斑马鱼的眼睛进行体视荧光显微镜(SFM)成像, 以作为对照。结果表明, OCT可高分辨率且大深度地显示斑马鱼玻璃体内RB细胞的三维分布, OCT图像分析可以定量说明RB细胞的数量变化情况, 且OCT结果与SFM结果高度匹配。综上所述, 斑马鱼模型与OCT成像技术结合的策略有望为RB疾病研究提供新的方法和装备。

小眼畸形相关转录因子(MITF)与黑色素细胞的形成关系密切。casper突变体斑马鱼是一种nacre与roy orbison杂交选育得到的双基因突变斑马鱼品系(mitfaw2/w2; roya9/a9)。通过对casper斑马鱼的鱼鳍和鳞片以及早期体色发育过程的观察, 证实了casper斑马鱼的臀鳍、背鳍与背部鳞片均无黑色素细胞, 并且在早期体色发育的过程中, 也未有黑色素细胞生成。构建mitfa过表达重组质粒, 并将其显微注射至casper斑马鱼受精卵中, 在其发育过程中观察到黑色素细胞的产生。结果进一步证实mitfa在鱼类体色形成尤其是在黑色素细胞发生方面发挥着重要作用。同时, mitfa过表达casper斑马鱼的制备, 也为深入开展鱼类体色分子调控机制研究提供了材料平台。

设计了一种基于线扫描成像(LSI)的光片荧光显微镜(LSFM),旨在通过抑制样本散射达到提高成像质量的目的。该显微镜将数字扫描光片荧光显微镜(DSLM)与LSI两种方法结合,以前者为基础,在探测光路上增加了一个用于解扫描的扫描振镜。在控制过程中,将照明光路的扫描振镜与解扫描振镜同步,使得均匀运动的图像在相机前固定于同一位置,从而实现了LSI。在系统中,为了便于与传统方法对比,线阵探测器通过面阵相机模拟实现。另外,与常规的LSFM相比,改进后的系统,在高散射荧光微球样品和斑马鱼心脏样品的成像实验中,更有效地抑制了样本散射。因此,验证该方法具有可行性。

MYO7A是人类Usher综合征(US)的致病基因。由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%～55%。研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型(USH1B), 包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性(RP), 但其分子机制尚不清楚。为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制, 利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。首先, 通过分析软件筛选出该基因的敲除位点, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该基因的向导DNA(gDNA), 再以gDNA为模板转录得到向导RNA(gRNA), 将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中; 随后, 进行基因编辑的有效性检测。研究结果表明, CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。对其进行进一步筛选, 成功获得斑马鱼myo7ab基因敲除突变品系, 这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。