Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) has been widely used to image the three-dimensional (3D) structures and functions of various millimeter-size bio-specimen such as zebrafish. However, the sample adsorption and scattering cause shading of the light-sheet illumination, preventing the even 3D image of thick samples. Herein, we report a continuous-rotational light-sheet microscope (CR-LSM) that enables simultaneous 3D bright-field and fluorescence imaging. With a high-accuracy rotational stage, CR-LSM records the outline projections and the fluorescent images of the sample at multiple rotation angles. Then, 3D morphology and fluorescent structure were reconstructed with a developed algorithm. Using CR-LSM, zebrafish’s whole-fish contour and blood vessel structures were obtained simultaneously.

adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员, 主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域, 与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用, 我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先, 通过分析软件筛选出该基因的敲除位点, 利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA), 再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收, 将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中, 得到F0代嵌合体。随后, 对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测, 结果表明, 注射的胚胎出现了碱基缺失的现象, 即sgRNA有效, 将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选adgrf3a突变杂合子, 并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序, 建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后, adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交, 获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现, adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异, 然而, 体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。

The zebrafish embryos were widely employed in genetics, development and drug discovery studies as miniatured animal models. Sorting of two-color fluorescent embryos is often required in large-scale experiments but it is challenging to manually sort with high efficiency. Here, we reported a high-throughput sorting system for two-color fluorescent zebrafish embryos. The embryos can be automatically loaded from a sample pool and sorted based on the average fluorescent intensity. The two-color fluorescent signals were split into two lines and detected by an area array camera. The system achieves the sorting of 100 embryos in less than 10min with an accuracy of greater than 95%.

GPR112蛋白作为黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员，由GPR112基因编码。它含有7个跨膜结构域，与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼作为研究脊椎动物发育的重要模式生物，其基因组中含有GPR112的同源基因gpr112a，且在幼鱼和成鱼中均有表达。为了研究GPR112在脊椎动物生存和发育中的作用，利用CRISPR-Cas9技术构建了gpr112a基因敲除斑马鱼品系。首先，合成用于靶向gpr112a基因第二外显子的一对sgRNAs，经显微注射得到F0代嵌合体斑马鱼。然后，对嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定，筛选gpr112a突变杂合子，并对其gpr112a突变等位基因进行Sanger测序，以确定gpr112a基因敲除品系的建立。之后，gpr112a突变杂合子斑马鱼自交，获得gpr112a纯合子突变斑马鱼。经显微成像并观察发现，受精后7 dpf的gpr112a突变纯合子斑马鱼并没有出现与野生型差异明显的表型，这可能是斑马鱼机体的代偿机制所致。此研究为探究GPR112基因在脊椎动物生存和发育中的作用开辟了道路。

心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)是bHLH家族的成员, 也称为dHand、Hed和Thing2, 可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达。国内外的研究显示, Hand2主要影响右心室的发育, 在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用。为了进一步研究Hand2基因参与心脏发育的作用机制, 拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Hand2基因敲除品系。根据生物信息学网站的分析筛选出最优的两个靶位点, 设计并合成引物, 利用PCR扩增得到Hand2基因sgRNA的cDNA, 再转录为mRNA, 将两个靶位点sgRNA的mRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞期。在斑马鱼的胚胎和成鱼时期进行基因敲除的有效性检测, 发现在靶位点附近有碱基的缺失和插入, 表明CRISPR/Cas9对斑马鱼Hand2基因敲除是有效的。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型, 为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。

斑马鱼广泛地应用于骨退化相关的机制研究和新药开发过程中。目前临床应用检测骨密度(BMD)的方法主要有单光子吸收、双光子吸收、双能X线吸收、定量CT和超声技术等, 上述方法均难用于斑马鱼的研究中。本文旨在寻求一种新式的、适用性强和操作简易的定量分析斑马鱼BMD的方法。对采集到的使用125 μmol/L泼尼松龙溶液诱导骨质疏松的斑马鱼在0、7、14、21 d的光学相干层析成像的图像依次进行灰度化、二值化、图像分割、阈值分割和密度投影, 最后进行了颅骨BMD统计。试验结果表明, 此方法可以有效地定量分析出不同天数斑马鱼骨质疏松程度, 适用于研究泼尼松龙诱导的不同天数对斑马鱼BMD的影响、大通量斑马鱼骨质疏松药物筛选、药物评价等, 是一种将斑马鱼颅骨BMD定量化分析的新方法。

斑马鱼(Danio rerio)是一种常见的模式生物, 红斑马鱼为小型观赏性鱼类之一。鱼类体色主要是由皮肤或鳞片上的色素细胞的种类和分布决定的。黑色素细胞诱导转录因子(MITF)主要调控动物黑色素细胞发育和分化。本文观察了红斑马鱼成鱼的背鳍、臀鳍、腹鳍、胸鳍色素细胞的组成和分布, 跟踪观察了红斑马鱼早期体色发育过程。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了mitfa基因敲除体系, 研究了mitfa基因在红斑马鱼早期体色发育中的作用。结果表明: 1)红斑马鱼鳍上分布有红色素细胞、黄色素细胞和少量的虹彩细胞, 但背鳍有大量的黑色素细胞; 2)在红斑马鱼早期体色发育过程中, 首先出现黑色素细胞, 接着出现黄色素细胞, 一个月后, 红斑马鱼的黑色素细胞消退, 鱼体表变浅红, 变色中体表颜色逐渐加深, 最后呈红色、银白色条纹相间分布的成鱼体色; 3)利用CRISPR/Cas9技术, 敲除mitfa基因, 结果发现, mitfa的缺失导致早期红斑马鱼黑色素细胞显著减少。上述研究结果将为观赏鱼的选育以及建立人工改良鱼类体色有效途径提供重要的理论支撑。

视网膜母细胞瘤(RB)严重损害儿童视力健康与生命安全。本研究建立了一种光学相干层析成像(OCT)辅助的RB斑马鱼模型构建的新方法, 并利用OCT对RB细胞在眼内的分布与存活状态进行活体评估。试验随机选取了24条正常斑马鱼作为研究对象, 其中21条鱼用于构建RB斑马鱼模型, 具体做法是在OCT实时成像下, 通过针剂注射带荧光的RB细胞到其玻璃体内部, 剩余3条鱼作为对照。细胞注射后的0、24、48、72 h观察RB细胞的分布与存活状态, 同时, 建模前后都对斑马鱼的眼睛进行体视荧光显微镜(SFM)成像, 以作为对照。结果表明, OCT可高分辨率且大深度地显示斑马鱼玻璃体内RB细胞的三维分布, OCT图像分析可以定量说明RB细胞的数量变化情况, 且OCT结果与SFM结果高度匹配。综上所述, 斑马鱼模型与OCT成像技术结合的策略有望为RB疾病研究提供新的方法和装备。

Zebrafish is an important animal model, which is used to study development, pathology, and genetic research. The zebrafish skin model is widely used in cutaneous research, and angiogenesis is critical for cutaneous wound healing. However, limited by the penetration depth, the available optical methods are difficult to describe the internal skin structure and the connection of blood vessels between the skin and subcutaneous tissue. By a homemade high-resolution polarization-sensitive optical coherence tomography (PS-OCT) system, we imaged the polarization contrast of zebrafish skin and the zebrafish skin vasculature with optical coherence tomography angiography (OCTA). Based on these OCT images, the spatial distribution of the zebrafish skin vasculature was described. Furthermore, we monitored the healing process of zebrafish cutaneous wounds. We think the highresolution PS-OCT system will be a promising tool in studying cutaneous models of zebrafish.