金纳米簇是一种制备工艺简单、具有分子级尺寸和量子效应的新型发光材料, 近年来在化学发光检测中得到了广泛应用, 特别是较多应用于体外生物检测。本文综述了金纳米簇化学发光(含电化学发光)体系在体外生物检测中的应用进展。首先, 阐释了金纳米簇的合成方法、结构、性质及其化学发光基本原理; 其次, 总结了国内外近年来基于该体系的体外生物检测研究进展, 并梳理了改善发光强度和检测灵敏度的已有策略; 最后, 对金纳米簇化学发光的未来发展趋势进行了展望。

基于三磷酸腺苷(ATP)适配体与ATP分子作用后可以显著增强电化学发光信号的性能, 研究了一种用于ATP含量检测的电化学发光适配体(ECL-aptamer)传感器。通过电沉积方法获得纳米金电极。3′端标记联吡啶钌发光分子的探针DNA通过5′端修饰的巯基自组装到纳米金电极表面, 然后与5′端标记二茂铁分子的ATP核酸适配体互补杂交, 形成刚性线形的双链DNA, 由此构建的传感器产生较弱的电化学发光(ECL)信号。该传感器在ATP溶液中孵化后, 由于ATP分子与ATP适配体强的特异性结合, 使得适配体分子与探针DNA分子解离, 从电极表面脱落进入溶液, 此时电极表面的探针DNA在强电解质溶液中可以形成发卡型的茎环结构, 产生显著增强的ECL信号。ECL信号强度与ATP浓度的对数值呈线性关系, 线性范围为10.0～1.0×105 pmol/L, 相关系数r=0.995 9, 检测限为5.0 pmol/L。该传感器的灵敏度与检测范围高于目前已报道的结果, 显示出了ATP检测的应用潜力。

以2-苯基吡啶为主配体、以氟修饰的吡啶-2-甲酸为辅助配体合成出一系列环金属中性铱配合物。产物结构通过核磁及质谱进行了确认, 对其光物理性能研究表明, 这些配合物的发光波长在498～516 nm之间, 属于绿光发射。没有氟取代的配合物Ir1量子效率最高, 达到32%, 而由于2位氟取代的位阻影响Ir4的量子效率最低只有6%, 其他氟取代配合物的量子效率在13%～16%之间。引入氟原子后配合物的氧化电位都有所增加, 氧化电位由511 mV增加到547～574 mV 之间。热稳定性也在氟取代后增加, 由142 ℃提高到187～380 ℃之间, Ir4提高的最少, 为187 ℃。应用于电致化学发光时, 除Ir4外, 氟取代都能增加其电致化学发光强度, 由332增加到333～370之间。而配合物Ir4的发光强度只有203。以上结果表明氟取代的效果跟位置有很大关系, 2位氟取代由于位阻效应, 使配合物的量子效率及稳定性都有不利影响, 而其他位置的取代则能提高配合物的这些性能。该研究结果对设计开发综合性能优异的发光材料具有借鉴意义。

对于三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)掺杂的SiO2纳米粒, 以聚电解质聚丙烯酸钠和成膜物质Nafion的混合液对纳米粒进行包覆, 制备了聚丙烯酸钠和Nafion混合膜包覆的电化学发光(ECL)纳米粒。结果表明: 混合膜包覆的纳米粒, 相对于Nafion膜的ECL信号增强了13倍。同时, 混合膜表面可交换阳离子显著增加, 能够通过离子交换固载大量的Ru(bpy)32+, 纳米粒的ECL信号可进一步增强约3倍。混合膜还具有另外一个显著的优势, 即通过混合膜的疏水相互作用可以方便地标记生物大分子, 标记抗体仍然具有良好的免疫活性。Membrane and Their Bio-labeling

设计合成了一系列以邻菲罗啉为第二配体的离子型环金属铱配合物, 通过核磁共振和质谱分析对其结构进行了表征, 通过紫外吸收光谱、荧光光谱和循环伏安法对其光物理性质进行了研究, 并测试了其电致化学发光性能。结果表明:配合物1［(pq)2Ir(phen)］(PF6)和2［(dpq)2Ir(phen)］(PF6)波峰在554.5 nm和566.5 nm处, 发射黄色光;3［(pqcm)2Ir(phen)］(PF6)和4［(pqca)2Ir(phen)］(PF6)波峰在621 nm和618.5 nm处, 发射红色光。几种配合物的荧光量子效率在2.5%~7.9%之间, 配合物1的量子效率最高, 为7.9%。配合物1的电致发光效率是最好的, 在相同条件下为三联吡啶钌 (［Ru(bpy)3］2+) 的 9.50倍, 表明该铱配合物在电致化学发光领域有很好的应用潜力。

利用环糊精类物质能够形成超分子包合物的性质, 研究了电中性的β-环糊精(β-CD)和负电性的羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)与电化学发光(ECL)活性物质三联吡啶钌(Ru(bpy)2+3)形成超分子包合物的能力及其对ECL的增强作用。结果表明: 形成的超分子包合物能够增强Ru(bpy)2+3的ECL, 其中CM-β-CD具有更强的增强作用。相对于Ru(bpy)2+3, CM-β-CD增强了1.42倍, 而β-CD仅为1.28倍。以制备的表面电荷为负的SiO2纳米粒为载体, 考察了其对Ru(bpy)2+3超分子包合物的吸附能力。结果表明, 与Ru(bpy)2+3的CM-β-CD超分子包合物相比, SiO2纳米粒载体对Ru(bpy)2+3的β-CD 超分子包合物表现出了更强的吸附能力。制备了ECL信号放大能力最强的β-CD-Ru(bpy)2+3超分子包合物的SiO2复合纳米粒。

Zeste同源染色体2增强子基因(EZH2)在人类乳腺癌中过度表达, 它可以被视为一个检测肿瘤的发展和转移的生物标记物。传统技术检测或定量特异性基因表达存在一些缺点, 因此, 本研究拟开发电致化学发光(ECL)技术来检测和量化EZH2 mRNA的表达量。在本研究中, 用生物素和三(2, 2 - 联吡啶)钌(II)(TBR)分别标记在PCR引物的5′ 末端上, 用作扩增靶基因, 扩增产物用ECL系统进行检测。我们用癌细胞作为模型分析了该方法的有效性和灵敏度, 并且将其应用于25例乳腺癌的临床样本中EZH2基因表达量的检测。检测结果表明, EZH2基因在肿瘤细胞系中过量表达, 而在正常血细胞中则低表达。最重要的是, 在25例临床乳腺癌样品中发现10例样品(40％)的EZH2 mRNA过度表达。此方法提供了一种新的工具来评估EZH2基因在乳腺癌中的表达水平, 且有可能成为一种快速、简便和灵敏的乳腺癌检测和诊断方法。

发展了一种可用于快速检测K-ras癌基因点突变的电化学发光PCR(ECL-PCR)分析方法,该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对目的片段进行PCR扩增;随后,采用限制性内切酶MvaI对扩增产物进行酶切,由于突变导致酶切位点的丢失,所以只有野生型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到反应池中进行电化学发光检测.采用该法对20例结肠癌组织中的K-ras癌基因第12位密码子进行点突变分析,得出其中有9例存在点突变,点突变率为45 %.该方法操作简便、安全、快速、灵敏,可用于快速检测K-ras癌基因点突变.

近年来发展了一种用于定量检测基因点突变的电化学发光PCR方法.该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对待测基因进行PCR扩增;随后,采用特定的限制性内切酶对扩增产物进行酶切,由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化,其中只有一种基因型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到样品池中;进行电化学发光检测,通过所得信号的有无可以判断其基因型.我们分别将该法用于Presenilin-1基因和H-ras癌基因的点突变检测,结果均可明显区分突变型样品和野生型样品.该法具有灵敏、快速、简便、安全等优点,是一种实用的基因点突变检测方法.

电化学发光基因检测是把电化学发光的高灵敏性和传统分子生物学方法的稳定性结合于一体的一种新型的基因检测技术.与传统的基因检测方法相比,它具有无放射性危害、高灵敏度、操作简便等优点.近年被广泛地应用于核酸序列分析,基因突变分析,遗传病、转基因物种、病毒、微生物等的检测.本文概述了电化学发光的基本原理以及传统的基因检测技术,详细地介绍了电化学发光在当前基因检测中的应用现状,并对其前景作了展望.