双光子成像(Two-Photon Imaging)技术以其优越特性被广泛用于活细胞动态三维成像, 但光功率极高的短脉冲光对焦平面荧光分子严重的光漂白极大地影响了双光子长时间成像的图像质量, 针对双光子荧光漂白问题, 本文提出一种优化光照的双光子(Optimized Lighting-Two Photon,OL-TP)成像技术。通过预扫描获取双光子图像分析高低阈值, 以预设的高低阈值为标准优化一幅图像中不同区域的光照时长, 利用扫描过程中记录的荧光信息和光照时间信息可以重建OL-TP图像, 既保证信噪比又降低荧光漂白。重建的OL-TP图像与传统双光子图像基本一致, 信噪比略有降低, 但图像并未失真。对110 nm的荧光小球样本分别连续取30幅普通双光子和优化光照的双光子图像, 到第30幅图时, 重建后的优化光照双光子图像比普通双光子图像荧光漂白降低了2886%。OL-TP通过优化光照时间大幅降低双光子成像的荧光漂白, 使双光子荧光显微镜能够更好地对生物样本进行长时间观测。

激发光引起的荧光漂白限制了共聚焦成像技术在长时间观测生物样本方面的应用。提出了一种基于可控光剂量的共聚焦成像技术(CLE-CM)，该技术通过预实验设置高低阈值，定时读取采样像素值并与预设阈值进行比较，根据比较结果控制每个物方像素的光照时间，以更高效地利用荧光信息，在不牺牲图像质量的情况下降低了荧光漂白。用CLE-CM和标准共聚焦对牛肺动脉内皮细胞样本连续成11幅图像，与第11幅标准共聚焦图像相比，第11幅CLE-CM图像的荧光漂白减少了52.62%，具体降漂白效果与样本中的荧光分布有关。CLE-CM通过减少光剂量大幅降低了共聚焦显微成像的荧光漂白，使共聚焦显微镜能连续成更多张高质量图像。

双光子荧光显微成像是一种非线性光学显微技术，具有高空间分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点。传统的双光子荧光显微成像通常使用波长可调谐的100 fs超短脉冲激光器作为激光光源。目前，人们对双光子荧光显微成像方法进行了深入研究，改进光源及探测方法是常用的手段。介绍和总结了多色双光子荧光显微成像技术的近期研究进展及其在生物医学中的应用。首先介绍了传统飞秒激光器及光学参量振荡器在多色成像中的应用，然后对光纤超连续谱在多色显微成像中的应用进行了分析，最后简要说明了增强自相位调制效应产生连续光谱以及选择性激发实现多色成像的工作。多色双光子成像技术不仅可以同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度双光子荧光图像，而且具有系统结构简单、操作简便等优点，这使得其在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景，并且为生物医学诊断与研究提供了一种有效的工具和平台。

受激辐射损耗显微成像(STED)是一种超分辨荧光显微成像技术, 它能够突破传统光学衍射极限的限制, 把远场光学分辨率提高到百纳米以内, 被广泛应用于生物医学等领域, 是目前光学显微成像领域研究的热点之一。采用了一种基于超连续谱皮秒脉冲白激光光源的STED显微系统, 实现超分辨成像。并从精密合束、脉冲延迟和损耗光残留光强几个方面探讨系统优化, 从而获得最佳的成像效果。对直径约25 nm荧光微球成像实验的数据表明: 该系统成像分辨率可达约60 nm, 分辨能力远远高于衍射极限。另外, 系统成功实现了对核孔复合物、微管和微丝等一系列生物样品的超分辨成像, 共聚焦成像中某些模糊不清的结构在STED成像中清晰可辨。

了解细胞内分子尺度的动态和结构的特征是生命科学迫切需要解决的问题, 要求远场光学成像要求纳米或亚纳米量级的空间分辨率。介绍了一种实现打破衍射极限的远场荧光显微成像技术--随机光重建显微术(STORM), 其分辨率可以达到横向分辨率20 nm, 轴向分辨率50 nm, 理论上这种方法的空间分辨率可以达到单分子定位的精度。具体介绍了其成像的基本原理, 在三维、多色成像方面的进展, 和目前面临的问题及今后的发展方向。

一般认为青蒿琥酯(ART)引起细胞凋亡是因为产生了活性氧（ROS）,从而启动多种凋亡途径。利用荧光染料2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和罗丹明(Rhodamine)123分别表征细胞中ROS的水平以及线粒体的膜电位，然后采用动态显微荧光成像技术在单个活细胞中实时监测ART诱导人类肺腺癌细胞（ASTC-a-1）凋亡过程中ROS的产生和线粒体膜电位的下降。结果显示0~50 μg/mL质量浓度的ART均能引起细胞活力的降低， 40 μg/mL质量浓度的ART能明显产生ROS，并且引起细胞线粒体膜电位的显著下降；CCK-8试剂对细胞活性的检测结果表明，ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以显著抑制ART诱导的细胞凋亡和线粒体膜电位下降，证明ART诱导了ROS依赖性的细胞凋亡和线粒体膜电位下降。

目的:对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点及适用范围进行了比较与评价.方法:分别应用LSCM、CCD、ICCD荧光显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、DIOC6(3)标记细胞内线粒体和内质网.采用细胞器-细胞荧光强度比值法,对 HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究.结果:LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160 μg/ml时的HMME 的荧光图像, 获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体和内质网平均荧光强度比值(J1/J2值)都明显高于细胞内J1/J2值.而 ICCD成像系统只需HMME浓度为5 μg/ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象.ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想.结论:LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂,适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究.二者获得的结果相一致:孵育24 h,HMME在鼠肺内皮细胞线粒体和内质网有分布而几乎不进入细胞核.ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制,实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低.

从光动力治疗癌症的疗效着眼研究酞菁配合物的三阶非线性光学性能.用时间分辨简并四波混频方法测量苯硫基钛菁锌(C56H32S4Zn),苯硫基铝酞菁(C56N32AlClN8S4)以及烷氧基铝酞菁(C56H32AlN8O4)的三阶非线性光极化率;测量四波混频响应的衰减过程;研究时间响应的超快过程和慢过程及其动力学机制,它们分别对应于单态和三线态的寿命.在荧光显微成像系统中观察三种酞菁光敏剂对人肝癌细胞杀伤的形态变化,并用MTT方法检测细胞存活率.对三种酞菁配合物的三线态量子产率和寿命进行测定,结果与它们对人肝癌细胞的光动力杀伤作用相关联.