为建立一种能够快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的普通PCR方法, 本研究分别以ASFV B646L和F778R基因为靶序列设计了两对特异性引物, 建立ASFV B646L和F778R双基因普通PCR方法, 并对其特异性、灵敏性及重复性进行检测。结果显示: 该PCR体系(25.0 μL体系)的最优组合为Pfu酶0.2 μL、10×Reaction Buffer 2.5 μL、2.5?mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL、B646L上下游引物各1.5 μL、F778R上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL; 退火温度为57℃、退火时间为30 s、72℃延伸2.5 min, 30个循环。该方法仅针对ASFV B646L和F778R基因进行特异性扩增, 无交叉反应。同时对B646L和F778R阳性质粒的最低检测下限分别为7.2×107 copies/μL、1.5×106 copies/μL, 试验重复性良好。本研究对于提高ASFV临床诊断的准确性、特异性和高效性具有重要价值, 为其快速检测提供了可靠的技术支撑。

短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23可产生非核糖体肽类抗生素伊短菌素, 已被广泛用于植物病害的生物防治。伊短菌素合成基因簇中, edeB基因参与调控伊短菌素的合成积累。本研究利用基因同源重组技术, 以edeB基因作为外源基因的重组片段, 构建了原核表达载体pET28a-edeB, 转化至大肠杆菌BL21(DE)中进行诱导表达; 通过转录组测序检测edeB基因在短短芽孢杆菌不同培养时间(12、18、24、30和36 h)的转录时相。结果表明: edeB基因全长为771 bp, 编码256个氨基酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示, 在分子质量为30 kD处有一条特异条带, 与生物信息学预测的EdeB蛋白的大小一致, 且EdeB蛋白主要以包涵体的形式存在。转录时相分析结果表明, edeB基因在各个培养时间点均有表达, 表达模式为先升高后降低, 且在30 h时表达水平最高。这些结果为进一步研究edeB基因调控伊短菌素合成积累的分子机制奠定了基础, 为短短芽孢杆菌高产伊短菌素菌株的构建提供了理论依据。

adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员, 主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域, 与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用, 我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先, 通过分析软件筛选出该基因的敲除位点, 利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA), 再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收, 将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中, 得到F0代嵌合体。随后, 对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测, 结果表明, 注射的胚胎出现了碱基缺失的现象, 即sgRNA有效, 将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选adgrf3a突变杂合子, 并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序, 建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后, adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交, 获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现, adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异, 然而, 体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。

视网膜极易因激光意外事故、中枢神经或视网膜退行性疾病发生异常改变, 严重威胁视功能。目前, 仍没有针对哺乳动物视网膜损伤的完善修复机制。视网膜“干细胞”穆勒胶质(MG)细胞不能自发进入细胞周期, 基因编辑手段可使MG细胞转分化, 从而具有视网膜祖细胞的能力。转分化相关信号通路及调控因子对MG基因组重编程至关重要。基因编辑治疗利用腺病毒、慢病毒等载体将外源基因导入体内, 促使哺乳动物受损视网膜中MG细胞激增和去分化, 损伤的视网膜神经元再生。与传统药物治疗需要长期服药相比, 基因疗法的出现有望实现通过一次治疗达到修复目的。文章就视网膜修复机制、调控视神经再生的信号通路以及基因治疗修复损伤视网膜研究现状和应用过程中存在的问题进行综述, 并展望未来相关的发展趋势。未来基因编辑治疗将会给视神经再生修复研究带来深刻变革, 为视网膜疾病的治疗带来新的曙光。

为深入分析人 SIRT1基因启动子及蛋白的结构和功能，本文采用生物信息学方法分析人 SIRT1基因 5′端启动子、启动子区 Motif、转录因子结合位点、甲基化 CpG岛、单核苷酸多态性、进化关系、理化性质、二级和三级结构、保守结构域、突变和翻译后修饰位点、互作蛋白及生物学功能。 TSSW和 Neural Network Promoter Prediction数据库预测其区间分别存在 3个、 2个启动子。 MEME数据库预测启动子区存在 3个 Motif。EMBOSS、MethPrimer和 CpG Finder数据库都发现 CpG岛聚集分布于 1 600～ 2 200 bp区。 PROMO和 AliBaba2.1数据库预测其启动子区域共同转录因子为 22个。 JASPAR软件获得 6个与正负链相结合的转录因子。 SNP Function Prediction数据库还发现不同种族等位基因频率存在差异。人 SIRT1基因位于染色体 10q21.3上，广泛分布在不同组织中。人 SIRT1蛋白由 747个氨基酸组成，属于亲水、不稳定的蛋白质，在不同物种间具有较高的保守性。结构域位于第 254～489位氨基酸序列，属于 SIR2超家族，主要分布在细胞核和线粒体中，二级结构主要以 α-螺旋和无规则卷曲为主，相比 AlphaFold2，SWISS-MODEL数据库构建的三级模型更可靠。 SIRT1蛋白共含有突变位点 106个、 N-糖基化位点 1个、磷酸化位点 61个，与 EP300、TP53等多种蛋白相互作用，并且参与昼夜节律过程、类固醇激素反应、细胞内受体信号等，涉及寿命调节通路、 AMPK信号通路、 FoxO信号通路等。本研究为了解 SIRT1对炎症反应等疾病的影响及感染机制提供了参考依据。

为了探究铜死亡相关基因在宫颈癌( CC)中的预后价值, 从 TCGA数据库下载 CC患者的临床资料, 随机分为训练组和验证组。通过单因素 Cox、LASSO-Cox和多因素 Cox分析筛选出铜死亡相关基因, 构建风险模型。通过 Kaplan-Meier曲线分析两个亚组和整个队列的总生存期( OS)、受试者工作特征曲线( ROC)和主成分分析(PCA)验证模型的预后价值。通过单因素和多因素分析来评价临床特征和风险评分的独立预后价值。利用基因本体( GO)和京都基因与基因组百科全书( KGEE)富集分析两个亚组间的生物学功能和途径, 并进一步分析了两个亚组对药物的敏感性。最终构建了 5个与铜死亡相关基因( FXD1、ARF1、APP、HSF1、MT1A)的预后模型。从风险评分的生存曲线来看, 低风险组的 OS远超过高风险组, 且预后良好( P<0.05)。单因素和多因素 Cox分析表明, 风险评分是独立的预后因素( P<0.001)。根据 ROC和 PCA证明了预后模型的预测能力。利用 ROC曲线分析评估风险评分和其他临床特征(如年龄、分级和分期)的敏感性和特异性, 结果表明, 风险评分的预后价值优于其他临床特征。富集分析结果表明, 基因功能主要富集于细胞外基质、细胞外结构。根据肿瘤免疫功能障碍与排斥(TIDE)算法, 低风险组患者的免疫治疗疗效优于高风险组。此外还发现 24种药物的敏感性在两个亚组中的显著差异。本研究建立了 5个铜死亡相关基因组成的预后风险模型, 并证明了该模型可以准确预测患者的预后, 且低风险评分的患者更易从免疫治疗中获益, 为临床个体化治疗提供理论依据。

WBP11是 WW结构域结合蛋白家族的一员, 参与前体 mRNA剪接过程, 是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一, 其基因组中含有人类 WBP11的同源基因 wbp11。为了研究 WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制, 利用 CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼 wbp11基因敲除品系。首先, 在 wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点, 体外转录合成 sgRNA, 通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除, 得到 F0代嵌合体斑马鱼。随后, 将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交, 所得到的 F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选出其中的杂合子斑马鱼, 并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序, 结果显示其为 wbp11基因的 2种缺失突变。让同种突变的 F1代杂合子斑马鱼自交, 对得到的后代 F2进行基因型鉴定, 筛选获得了纯合子斑马鱼, 表明 wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现, 受精后 48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形, 这可能是由于 wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究 WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路

脱镁叶绿酸a加氧酶（PaO）基因编码叶绿素降解过程中的关键酶。为了解小麦（Triticum aestivum L.）TaPaOs基因家族特征及其在衰老过程中发挥的作用，本试验利用已发布的小麦及其他物种的全基因组信息对TaPaOs家族成员的基因特性进行分析，并利用实时荧光定量PCR（qRT-RCR）技术初步分析其功能。结果表明：在小麦中共发现18个TaPaOs家族成员，分布在15条染色体上，其编码蛋白均具有亲水性，且大多数为不稳定蛋白，亚细胞定位预测均位于叶绿体中；18个TaPaOs家族成员启动子区包含大量响应元件，其中光响应元件（G-Box）和ABA响应元件（ABRE）最多。分析TaPaOs在不同组织中的表达模式发现，其家族成员表达模式为叶>茎>根，大多数家族成员在ABA诱导衰老、黑暗诱导衰老以及自然衰老时上调表达，尤其是TaPaO2、TaPaO5及TaPaO6，可作为小麦衰老研究的重点关注基因。这些研究结果为进一步研究TaPaOs基因家族的功能奠定基础。

同龄的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)呈现明显的两性生长差异，即雄性个体的体长、体重皆大于雌性个体。而mTOR信号通路在细胞生长、发育以及蛋白合成过程中起重要作用。为了了解黄颡鱼两性差异的营养生长机制与mTOR信号通路之间的关联性，本试验首先在生理生化特性方面对雌、雄黄颡鱼的肌肉营养成分进行了比较分析。结果表明，在雌、雄黄颡鱼的比较分析中，除了两者的水分、粗蛋白、粗脂肪含量差别不大以外，在矿物元素、氨基酸组成、蛋白的氨基酸组成和脂肪酸组成等方面，雌性黄颡鱼肌肉的营养品质相对雄性更优。针对mTOR信号通路主要基因开展实时荧光定量PCR分析，结果显示，除性腺组织外，AKT1、AKT2、AKT3、mTOR、S6KA、S6KB、4E-BP1基因在雄性黄颡鱼的肌肉、肝、肾和心脏组织中的表达均显著高于雌性，这可能与雌雄黄颡鱼生长差异有关。本研究为进一步探索黄颡鱼两性生长差异的分子机制奠定了试验基础。