单分子免疫检测,是指将免疫复合物限制在极小的体积内,对产生的信号进行计数,是一种“数字化”的免疫检测技术。单分子免疫检测仪的核心类似于一个荧光显微系统,但普通的荧光显微镜结构复杂,且与生物芯片规格无法匹配,不能很好地满足检测需求。针对自行研制的生物芯片规格,合计了一套高性能的单分子免疫检测光学系统。根据设计要求,确定了合适的初始结构; 在荧光显微系统原理和像差分析理论的基础上,使用光学设计软件Zemax对系统进行反复优化设计; 设计出了满足单分子免疫检测成像要求的光学系统。系统的成像部分由15片折射透镜组成,工作距离为4mm,放大倍率为-4.52,调制传递函数值在奈奎斯特频率73lp/mm处均大于0.44,畸变为0.8%,照明部分采用柯勒照明方式,在整个视场范围内,物面上的照度均匀度达到97%。整个系统采用国产常规玻璃,有利于加工和降低成本。经优化后的高分辨率荧光显微系统结合当前发展成熟的全自动化检测技术,可以极大提高单分子免疫检测的检测灵敏度和准确率。

提出一种基于氧化石墨烯包裹金纳米壳(EGO-AuNS)修饰长周期光纤光栅(LPFG)的新型免疫传感器,并将其应用于禽流感病毒(AIV)检测。利用静电结合原理将石墨烯(GO)包裹在金纳米壳(AuNS)表面形成EGO-AuNS复合材料;采用硅烷偶联剂以共价键结合方式将其固定在LPFG表面;再以AIV单克隆抗体(AIV-MAbs)为特异性生物分子识别单元,固定于光栅表面构成EGO-AuNS-LPFG免疫传感器。结果表明:在折射率(RI)1.333--1.411范围内,EGO-AuNS-LPFG传感器RI灵敏度高达-66.60 nm/RIU,约为普通LPFG传感器的6倍。通过对不同浓度等级AIV抗原溶液的检测,表明该免疫传感器的检测极限约为8 ng/mL,饱和点约为50 μg/mL,在其线性响应区域的检测灵敏度约为2946.25 pm/(μg·mL -1),约为基于GO涂覆包层腐蚀型普通LPFG的AIV免疫传感器灵敏度的7.3倍;此外,其对AIV分子的解离系数约为3.49×10 -9 mol/L。通过对几种尿囊液的对照检测实验,表明该免疫传感器且具有良好的特异性和临床性有效性,因此它在生物医学领域有较大应用潜力。

光电化学法是在光照射下, 将化学能转换为电能的低成本方法。而光电化学生物传感技术由于具有通过生物分子氧化产生的光电流来检测生物分子的能力而引起了广泛的关注。光电化学生物传感器具有低成本、高灵敏度、高特异性、仪器操作简单以及检测背景信号低等特点, 在免疫检测和生物技术等重要领域具有广泛应用前景。近年来, 对于光电化学生物传感器性能和检测方法的研究也取得了颇丰的成果。本文主要介绍光电化学生物传感器的概念及基本原理、分类应用及对其未来的展望。

基于Ag包覆聚苯乙烯球(PS@Ag)纳米探针和Ag覆盖硅金字塔结构(Si@Ag)阵列基底构建“三明治”免疫结构, 开展表面增强拉曼散射(SERS)特性研究, 实现了肝癌肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)的高灵敏、高特异性的检测.通过硝酸银原位还原生成PS@Ag纳米粒子, 再依次链接4-巯基苯甲酸(4-MBA)及甲胎蛋白抗体(Anti-AFP) 制备得到PS@Ag免疫探针.采用Langmiur-Bloggt膜技术、等离子体刻蚀和湿法刻蚀技术, 以PS球阵列为模版, 刻蚀大面积硅金字塔结构, 再依次沉积Ag膜和链接Anti-AFP制备得到免疫基底.结果表明, 基于“三明治”免疫结构的SERS检测方案具有高灵敏度(检测极限为1.75 fg·mL－1)和宽的动态范围(2 fg·mL－1~200 ng·mL－1).此外, 对临床人体血清样品进行SERS免疫检测, 得到了与化学免疫发光法一致的结果, 而且具有更高的灵敏度, 可应用于肝癌的早期检测与诊断.

近年来, 环境内分泌干扰物愈来愈受到人们的关注。 对其用传统的检测技术分析, 过程复杂、 耗时长、 价格昂贵, 因此急需发展灵敏度高、 反应迅速快、 价格低廉的检测手段。 介绍了一种平面波导型阵列倏逝波荧光生物传感器, 在对系统光路参数进行模拟优化的基础上, 可实现24个传感位点的同步、 快速、 灵敏检测。 基于此阵列倏逝波荧光传感器, 运用间接竞争免疫检测模式, 优化并建立环境内分泌干扰物雌二醇的标准检测条件。 实验结果表明, 入射角在61.8°时, 系统灵敏度最高。 该方法对雌二醇检测线性检测区间为0.08~2.52 μg·L-1, 检测限为0.05 μg·L-1, 半抑制浓度为0.46 μg·L-1, 完成单次样品的检测时间为20 min。 利用该传感器对污水处理厂出水进行加标回收测试, 回收率在84%~120%之间, 相对标准偏差小于15%, 表明该方法能够用于实际水体中雌二醇的快速检测。

基于金/银纳米三明治结构的表面增强拉曼散射(SERS)特性,实现了前列腺特异性抗原(PSA)高灵敏度免疫检测,检测结果具有特异性。采用化学还原法制备金、银纳米粒子, 用4-巯基苯甲酸(4-MBA)及前列腺特异性抗体(Anti-PSA)链接金、银纳米粒子制备免疫探针, 在硅片表面原位生长金、银纳米粒子并链接Anti-PSA制备得到免疫基底。将免疫探针、免疫基底以及PSA组成三明治结构, 进行基于SERS特性的免疫检测。实验结果表明, 纳米银免疫探针与纳米银免疫基底组成的三明治结构具有最佳的检测效果, PSA的检测灵敏度低至1.8 fg/mL(3.490×10-18 mol/L), 可应用于前列腺癌症的早期检测与诊断。

对于增强化学发光酶联免疫分析而言, 检测结果、计数效率、信噪比等重要参数不仅与光子计数装置有关, 而且与光学发光体系的光子脉冲发射统计过程相关。本文实验测量了增强鲁米诺化学发光体系的光子脉冲的统计特性, 并根据其脉冲发射时间统计特性对化学发光光子计数检测装置的设计进行了理论分析。研究结果表明, 化学发光的光子脉冲发射间隔呈Weibull分布。

量子点(QDs)所具有的一元激发多元发射的特点预示着QDs在高通量的多元量化生物信息处理领域具有应用前景。采用柠檬酸钠直接还原法制备了粒径为15 nm的Au纳米粒子, 利用静电自组装的方法构建了Au与QDs的荧光共振能量转移(FRET)系统。采用该系统研究了QDs的尺寸变化对FRET效率的影响, 获得了FRET效率和给体与受体之间交叠积分的关系。结果证明, QDs是构建多元均相免疫检测技术的一个有效给体。

为实现化学发光免疫检测方法的临床应用，在深入分析化学发光免疫检测过程的基础上，对其涉及的各项关键技术进行了研究。针对化学发光免疫检测过程的3个关键环节: 加样、洗涤和测量，提炼出化学发光免疫检测仪涉及的3项关键技术: 微量液体试样精确加样技术、免疫复合物充分无损分离技术、微弱闪光信号精确测量技术。在液体加样方面，通过微升级别液体加注过程的分析及仿真给出加样模块相关参数的优化原则; 在免疫复合物分离方面，通过复合物颗粒磁分离过程的分析给出磁场设计原则; 在光检方面，给出了测量室设计原则及光电信号数据处理原则。在攻克上述关键技术的基础上，研制出Autolumis 3000化学发光免疫分析仪并成功实现临床应用。测试结果表明，仪器的变异系数 (Coefficient of variance，CV)为5%，最大检测速度为每小时180次，达到国外同类高端仪器的水平，表明所研究的关键技术是可行的。

结合表面等离波子共振(SPR)技术与免疫检测技术，研究和建立了一种响应速度快、免标记、低成本的地表水微囊藻毒素（MC-LR）检测方法。基于SpreetaTM传感器构建了小型SPR免疫检测系统，采用共价偶联方法在传感器金膜表面修饰MC-LR-BSA抗原为生物敏感膜；开展了MC-LR的SPR免疫检测方法实验研究，结果表明该方法的相对标准偏差为1.0%(n=6)，定量范围为2~32 ng/mL，检测限为0.63 ng/mL，半抑制浓度CI50为10.7 ng/mL，空白加标回收率和样品加标回收率在90%~113%之间。实样检测实验中，管道末梢饮用自来水水样未能检测出MC-LR，而某湖水水样中MC-LR的质量浓度为2.46 ng/mL。实验研究与结果表明，MC-LR的SPR免疫检测方法可以满足世界卫生组织(WHO)对于饮用水中MC-LR最低含量检测的需求。